研究发现,除具备成瘾性以外,尼古丁还通过激活非神经元烟碱乙酰胆碱受体(n ACh Rs)发挥其他生物效应,进而诱导多组织器官损伤[1].如,吸烟可诱导不同类型癌症、动脉粥样硬化性血管病(包括冠心病和卒中)、阻塞性肺病、骨质疏松和消化性溃疡病等[2].研究表明,吸烟在慢性肾脏疾病(CKD)的进展中发挥重要作用,尼古丁摄入与糖尿病、高血压、多囊肾病和肾移植后患者CKD的恶化风险存在密切关联[3].现阶段,针对尼古丁源性肾损伤的治疗仍以药物和姑息手段为主,但其发病率仍在不断上升,因此,需要预防或减轻尼古丁源性肾损伤进展及其靶器官影响的新疗法.

研究认为,有氧运动可改善机体肾组织功能,减少微量白蛋白尿,恢复氧化平衡,进而延缓慢性肾损伤进展,持续炎症、氧化应激和组织纤维化在急性肾损伤(AKI)向CKD进展中发挥重要作用[4].有氧运动可通过抗炎、抗纤维化、抗氧化和自噬上调机制预防并减轻草酸钙晶体诱导的AKI[5].核因子κB(NF-κB)参与调节多器官组织免疫和炎症反应,在AKI和CKD病程发展中发挥重要作用.尼古丁可广泛激活机体NF-κB信号通路,诱导多组织器官炎症反应和组织细胞损伤[6].腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是NF-κB信号通路的重要上游调控分子,AMPK/NF-κB信号通路的炎症反应调控机制已被广泛认可[7].

遗憾的是,目前尚缺乏有氧运动手段干预促进尼古丁诱导肾损伤恢复的直接证据,但有学者猜测有氧运动的抗炎、抗氧化应激效应可能在其中发挥核心机制[8].基于此,本研究拟探讨游泳运动对尼古丁胁迫(NS)大鼠肾损伤的干预作用,同时验证AMPK/NF-κB信号通路在NS肾损伤干预中的作用,为运动促进NS诱导的肾损伤康复提供思路和实验依据.

1、材料和方法

1.1实验对象

36只6周龄SPF级雄性SD大鼠由新疆医科大学实验动物中心提供,动物生产许可证号为SCXK(新)2016-0002,动物使用许可证号为SYXK(新)2016-0003.本研究通过喀什大学实验伦理委员会审查(KSU202207-02),实验均遵循动物实验伦理原则.大鼠饲养环境:温度23～25℃,湿度55%～60%,光照条件每天12h,自由摄食水.

1.2仪器与试剂

主要仪器:大鼠恒温泳池(上海软隆科技公司),全自动组织切片机(KH-Q330,湖北阔海医疗科技公司),显微图像分析系统(TE2000-U,日本奥林巴斯公司),酶标仪(imarkBio-Rad,美国伯乐公司),全自动尿液分析仪(URIT-1600PLUS,桂林优利特医疗电子公司),高速冷冻离心机(5424R,德国艾本德公司),EP凝胶成像系统(Alpha ImagerEP,美国Protein Smi ple公司),电泳系统(GenePulserXcell,美国伯乐公司),蛋白转印系统(170-3930,美国伯乐公司).主要试剂:尼古丁购自美国Sigma公司,白介素-6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)酶联免疫试剂盒购自南京建成生物公司,RIPA裂解液、DAB显色试剂盒、抗α-SMA抗体、抗KIM-1抗体、6.6cm×8.5cm PVDF膜、免疫组化洗涤和封闭试剂盒购自上海碧云天生物公司,BCA蛋白浓度测定试剂盒、β-actin内参抗体、Mouse源二抗、Rabbit源二抗购自美国CST公司.

1.3分组、建模与运动干预方案

实验动物适应性饲养3d后,随机取24只大鼠,参照Ramalingam等[9]研究中NS模型大鼠的构建方法,大鼠接受尼古丁腹腔注射(2.5mg·kg-1·bw·d-1),连续4周,灭菌注射用水配置尼古丁所需浓度;剩余12只大鼠不接受腹腔药物给药,正常饲养.末次尼古丁腹腔注射次日,采用m L无菌注射器于膀胱取尿液,全自动尿液分析5仪检测尿蛋白、尿素氮及尿酸水平.试验过程中可能因尼古丁的毒性作用或其他原因,导致2只大鼠死亡(尼古丁胁迫建模第22d、第24d各1只).参照Ramalingam等[9]研究中对尼古丁源性肾损伤的评价标准(尿蛋白(UP)≥500mg·L-1、尿肌酐(Ucr)≥200mg·L-1、尿酸(UA)≥3.5mmol·L-1),最终20只大鼠成功建立尼古丁胁迫模型,成模率为83.3%.20只尼古丁胁迫模型大鼠随机分为尼古丁胁迫组(NS组)及尼古丁胁迫+运动组(NS+Ex组),每组10只,剩余12只大鼠设置为正常对照组(NC组),NS+Ex组大鼠进行适应性游泳训练3d(每天1次,每次15min);NC组和NS组不接受运动干预,正常饲养.适应性游泳训练后NS+Ex组进行连续8周游泳运动(每周6d,每次40min).运动干预期间各组大鼠无死亡.

1.4取材

末次游泳运动后次日,空腹麻醉,腹主动脉取血,全血室温自凝45min,4℃,2000r·min-1离心10min取上清即为血清,-80℃保存.迅速取大鼠肾组织,右肾制备切片,取左肾500mg加入PBS匀浆介质,2000r·min-1匀浆1min,匀浆液转移至离心管,4℃,6000r·min-1离心10min,取上清-80℃保存.

1.5酶联免疫吸附试验

取血清及肾组织匀浆液,采用酶联免疫吸附试剂盒检测肾组织白介素-6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,以及血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平.

1.6免疫组织化学染色

取右肾,切片并脱蜡、复水,经抗原修复,分别加抗α-SMA抗体(1∶200)及抗KIM-1抗体(1∶250),4℃孵育过夜,PBS缓冲液清洗,二抗孵育,按照DAB显色试剂盒流程进行显色反应.显色终止后使用苏木素染色液将核染为蓝色,染色结束后脱水、封片,观察所显棕黄色的面积与颜色深浅,即α-SMA和KIM-1表达水平.

1.7蛋白免疫印迹

取大鼠肾组织匀浆液,采用RIPA法提取组织总蛋白,4℃,12000r·min-1离心20min;取上清液使用BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度,加入5×SDS缓冲液,95℃变性15min.配置SDS-PAGE凝胶,浓缩胶恒压80V电泳30min,分离胶恒压110V电泳至溴酚蓝到达分离胶底部,20μg上样,用电转法将蛋白质转移到PVDF膜上.5%脱脂牛奶室温封闭1h,加入一抗(1∶1000稀释),4℃摇床孵育过夜;TBST洗膜10min×3次,加二抗(1∶3000稀释),37℃孵育40min;TBST洗膜10min×5次.ECL法显影,凝胶成像系统成像后使用QuantityOne3.0软件分析,以β-actin作为内参,计算目的蛋白相对表达量.

1.8统计学分析

采用SPSS25.0统计学软件进行统计分析,数据以平均值±标准差表示,两样本平均数间比较采用t检验分析,P<0.05表示有显著性差异.

2、结果

2.1大鼠血清肾功能指标的变化

由图1(a)可见,与NC组比较,NS组大鼠血清BUN和Scr水平显著上升(P<0.05).与NS组比较,NS+Ex组血清BUN和Scr水平显著降低(P<0.05).

2.2大鼠肾脏氧化应激指标的变化

由图1(b)可见,与NC组比较,NS组大鼠肾组织MDA水平显著上升,SOD和GSH-px水平显著降低(P<0.05).与NS组比较,NS+Ex组肾组织MDA水平显著降低,SOD和GSH-px水平显著上升(P<0.05).

2.3大鼠肾脏炎症反应指标的变化

由图1(c)可见,与NC组比较,NS组大鼠肾组织IL-1β,IL-6和TNF-α水平显著上升(P<0.05).与NS组比较,NS+Ex组肾组织IL-1β,IL-6和TNF-α水平显著降低(P<0.05).

图1各组大鼠肾功能、氧化应激和炎症反应指标检测结果  

与NC组相比,*P<0.05;与NS组相比,#P<0.05(下同)(a)各组大鼠血清肾功能指标结果(b)各组大鼠肾组织氧化应激指标结果(c)各组大鼠肾组织炎症反应指标结果

2.4大鼠肾组织α-SMA和KIM-1表达

由图2(a)和(b)可见,与NC组比较,NS组大鼠肾组织α-SMA和KIM-1表达水平显著上升(P<0.05).与NS组比较,NS+Ex组肾组织α-SMA和KIM-1表达水平显著降低(P<0.05).

2.5大鼠肾组织Bax和Bcl-2蛋白表达

由图2(c)和(d)可见,与NC组比较,NS组大鼠肾组织Bax蛋白表达显著上升,Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05).与NS组比较,NS+Ex组肾组织Bax蛋白表达显著降低,Bcl-2蛋白表达显著上升(P<0.05).

2.6大鼠肾组织AMPK/NF-κB通路相关蛋白表达

就NF-κB通路相关蛋白而言,与NC组比较,NS组大鼠肾组织IκBα及p-IκBα蛋白表达显著降低,NF-κBp65及p-NF-κBp65蛋白表达显著上升(P<0.05);与NS组比较,NS+Ex组肾组织IκBα及p-IκBα蛋白表达显著上升,NF-κBp65及p-NF-κBp65蛋白表达显著降低(P<0.05),见图3(a)和(b).就AMPK通路相关蛋白而言,与NC组比较,NS组大鼠肾组织p38,p-p38,JNK及pJNK蛋白表达显著上升,ERK1,p-ERK1,ERK2及p-ERK2蛋白表达显著降低(P<0.05).与NS组比较,NS+Ex组肾组织p38,p-p38,JNK及pJNK蛋白表达显著降低,ERK1,p-ERK1,ERK2及p-ERK2蛋白表达显著上升(P<0.05),见图4(a),(b)和(c).

3、讨论

3.1游泳运动对尼古丁胁迫大鼠肾功能和肾损伤的影响

肾小球滤过率(e GFR)和血清肌酐(Scr)是早期肾损伤的可靠标志物,也可以作为肾小球病变的敏感指标.研究认为,尼古丁溶液灌胃可导致小鼠e GFR和Scr显著上升,诱导肾小管功能异常、肾单位萎缩和肾小动脉硬化等症状[10].血尿素氮(BUN)是机体蛋白质代谢的终产物,长期吸烟人群BUN水平高于同龄非吸烟人群,BUN可作为肾损伤的早期诊断标准.肌成纤维细胞活化是肾纤维化和肾损伤发生的核心环节,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和肾损伤分子1(KIM-1)的激活与转化是成纤维细胞活化的主要来源,因而成为肾纤维化和肾损伤的诊断和治疗靶点[11].在本研究中,经腹腔注射尼古丁后,大鼠血清BUN,Scr和肾组织α-SMA,KIM-1水平显著上升,说明本研究成功建立了尼古丁源性肾损伤模型.目前尚缺乏运动对尼古丁诱导肾损伤的干预研究,但部分间接证据显示,运动干预可有效改善单侧肾I/R、雷帕霉素、糖尿病等诱导的肾功能损伤[12].有氧运动在慢性肾损伤康复领域被广泛应用,Oliveira等[13]发现,有氧运动可有效减轻庆大霉素诱导的大鼠肾损伤并促进损伤后肾功能康复.Yang等[14]亦证实,4周有氧运动可通过改善e GFR、调节肾小球内压、提高肾内蛋白产物排泄效率等方式减轻早期糖尿病肾损伤.在本研究中也发现了类似的现象,8周游泳运动干预后,尼古丁胁迫大鼠血BUN、Scr和肾组织α-SMA、KIM-1表达显著降低,病理学检查显示,大鼠肾组织炎症组织浸润和微细结构损伤减轻,细胞形态及边界组织趋于正常.

图2各组大鼠肾损伤和凋亡相关蛋白表达  

(a)各组大鼠α-SMA和KIM-1在肾组织的免疫组织化学结果;(b)各组大鼠α-SMA和KIM-1在肾组织的表达统计图;(c)各组大鼠Bax和Bcl-2在肾组织的Western Blotting结果;(d)各组大鼠肾组织Bax和Bcl-2蛋白的相对灰度值变化统计图

图3各组大鼠肾组织NF-κB通路相关蛋白表达 

(a)各组大鼠IκBα,p-IκBα,NF-κB,p-NF-κB在肾组织的Western Blotting结果;(b)各组大鼠肾组织IκBα,p-IκBα,NF-κB,p-NF-κB蛋白的相对灰度值变化统计图

图4各组大鼠肾组织AMPK通路相关蛋白表达 

(a)各组大鼠p38,p-p38,JNK,P-JNK,ERK1/2,p-ERK1/2在肾组织的Western Blotting结果;(b)和(c)各组大鼠肾组织p38,p-p38,JNK,P-JNK,ERK1/2,p-ERK1/2蛋白的相对灰度值变化统计图

3.2游泳运动对尼古丁胁迫大鼠肾脏氧化应激和炎症反应的影响

氧化应激和炎症反应直接或间接参与多种与吸烟相关的疾病(动脉粥样硬化、肾损伤和肝损伤等)和病理生理反应(巨噬细胞功能障碍、内皮屏障功能障碍、足细胞损伤和泛素介导的蛋白酶体加工)进展[15].尼古丁或可替宁与肾组织炎症浸润、促炎细胞因子激活和NF-k B的活化直接相关,现阶段的研究认为,尼古丁可能诱导巨噬细胞增殖促进炎性损伤和组织纤维化[16].动物实验证实,烟雾暴露大鼠肾组织NF-κB/I-κB蛋白复合物被广泛降解,NF-κB迅速易位至肾细胞核,进而促进TNF-α,IL-1β和IL-6等炎症因子活化;此外,Nrf2可通过结合ARE促进诱导型环氧化酶(COX)亚型COX-2表达上升[17].有氧运动对多途径诱发的氧化应激和炎症反应具有抑制作用,8周游泳运动方案可有效激活庆大霉素诱导的AKI动物模型肝脏、骨骼肌和肝脏氧化应激标志物MDA,SOD水平,同时提高骨骼肌等多器官组织CAT活性[13].就运动干预方案而言,无论AKI模型建立前预处理还是AKI恢复阶段运动方案均对庆大霉素、糖尿病、高强度训练诱导的肾氧化应激和炎症反应具有抑制作用[18].人体运动实验证实,长期、规律有氧运动后,糖尿病肾病患者SOD和一氧化氮(NO)等抗氧化物活性被激活,抗氧化酶活性增强和氧化应激抑制表明运动可降低AKI向CKD进展风险[19].本研究也发现,游泳运动可有效抑制尼古丁诱导的肾组织氧化应激和炎症反应.一项针对顺铂类药物诱导肾损伤模型的运动干预研究发现[20],5周有氧运动可通过抑制KIM-1和Scr生成、抑制CD4+细胞活性和TNF-α水平,也有学者认为T细胞在急慢性肾损伤中发挥核心作用[21].因此T细胞的调节效应可能是运动促进尼古丁源性肾损伤的核心机制,但其具体机制仍有待进一步研究.

3.3游泳运动对尼古丁胁迫大鼠肾脏细胞凋亡的影响

现阶段,尚缺乏尼古丁胁迫对肾组织细胞凋亡影响的相关研究,但部分侧面证据可能作为研究的辅证.有学者认为,高剂量尼古丁可通过抑制烟碱型乙酰胆碱受体(n ACh R)受体而激活心肌组织凋亡程序[22].B淋巴细胞瘤(Bcl)家族中的Bcl-2,Bax基因是目前已知的细胞凋亡中最重要的调控组分,可通过线粒体途径介导NOD样受体家族3(NLRP3)等物质释放,通过其氧化应激效应或促进氧自由基生成激活细胞程序性死亡[23].动物实验结果显示,糖尿病肾病、庆大霉素和顺铂诱导肾损伤模型大鼠肾组织Bax蛋白表达上升、Bcl-2蛋白表达降低[24].Bax/Bcl-2比值失衡与肾组织炎症反应激活密切相关,因此,外源性刺激诱导的肾组织细胞凋亡亢进可能介导了自身的炎症激活效应.本研究发现,高剂量尼古丁可导致大鼠肾组织细胞凋亡激活,但与炎症反应的联系仍有待进一步研究.已经证实,有氧运动可以发挥损伤组织凋亡调控的作用,如Duan等[25]发现,游泳运动通过抑制肾间质纤维化和细胞凋亡减轻高血压诱导的肾功能障碍.Hamano等[26]对顺铂顺铂诱导AKI大鼠进行运动干预发现,6周有氧运动可减轻顺铂对肾组织细胞凋亡的扰动.亦有部分研究证实,有氧运动可有效抑制烟雾刺激、低氧暴露诱导的肺组织凋亡反应.

3.4游泳运动对尼古丁胁迫大鼠肾组织AMPK/NF-κB信号通路的影响

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)广泛参与内质网应激、氧化应激、细胞凋亡和自噬等生理反应调控过程,活化的AMPK通过沉默因子Sir1(SIRT1)、叉头框蛋白O(FOXO)、雷帕霉素靶蛋白(m TOR)、NF-κB等调节级联信号抑制NO和ROS生物活性减轻氧化应激诱导的组织损伤[27].生理条件下,核因子κB(NF-κB)的活化位点被细胞质中的IκB占据,但在炎症刺激下IκB被广泛磷酸化并随后降解,NF-κB被转移至细胞核并乙酰化,以激活包括促炎介质在内的多个靶基因的转录活性[28].体外实验证实了AMPK与NF-κB的调控关系,在骨髓中性粒细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞原代培养物中激活AMPK,可有效抑制IκB激酶(IKKα/β)活性和IκB对促炎细胞因子的响应[29].此外,AMPK缺陷小鼠胚胎成纤维细胞显示,AMPK激活可能直接抑制NF-κB活性.介于急慢性肾损伤是一种细胞因子过量状态,受MAPK(p38MAPK,JNK和ERK),AKT和AMPK等诸多信号通路的协同调控.课题组假设,尼古丁诱导的AMPK抑制和NF-κB激活可能与氧化应激、炎症反应诱导的肾损伤有关.多项研究证实,运动可参与调控AMPK/NF-κB信号通路并减轻或促进组织损伤恢复[30].张坦等[31]发现,游泳运动可通过激活AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路抑制糖尿病小鼠骨骼肌炎症因子表达,减轻糖尿病诱导的骨骼肌炎症反应.朱洪竹等[32]亦证实了游泳运动对糖尿病肾病大鼠肾组织NF-κB-p65的抑制作用.本研究发现,游泳运动可以激活尼古丁胁迫大鼠肾组织AMPK通路,抑制NF-κB通路及相关蛋白表达.推测AMPK在游泳运动改善尼古丁胁迫大鼠肾损伤中的作用机制为通过激活自身活性进而抑制下游NF-κB通路,改善尼古丁胁迫条件下肾组织氧化应激和炎症反应,发挥肾组织保护效应.

综上所述,8周游泳运动可改善尼古丁胁迫大鼠肾功能,减轻肾组织氧化应激和炎症反应,下调肾损伤标志物表达,抑制肾组织细胞凋亡和组织纤维化;游泳运动可能通过激活AMPK通路活性并抑制NF-κB通路活性,进而发挥肾组织保护作用.

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基金资助:国家自然科学基金资助项目(31660736);新疆维吾尔自治区高校科技计划项目(XJEDU2021SY040);

文章来源:孔海军,翟德强,谌晓安等.游泳运动调控AMPK/NF-κB通路减轻尼古丁胁迫大鼠肾损伤[J].西北师范大学学报(自然科学版),2024,60(01):76-83.