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大鼠呼吸机相关性肺损伤中JAK2/STAT3信号通路的作用机制研究

2020-08-27 591 上传者：管理员

摘要：目的探讨蛋白酪氨酸激2/信号转导子与激活子3(JAK2/STAT3)信号通路在大鼠呼吸机相关性肺损伤(VILI)中的作用机制。方法按照体重将模型大鼠随机分为2组:模型组、抑制剂组,每组10只;另取20只正常大鼠作为正常组和溶剂组。建立VILI大鼠模型。造模前1 h,抑制剂组大鼠尾静脉注射AG490(JAK2/STAT3信号通路抑制剂)溶液10 mg·kg-1,溶剂组注射等剂量的二甲基亚砜,正常组和模型组注射等剂量的0.9%NaCl。以酶联免疫吸附法测定大鼠肺组织的髓过氧化物酶(MPO)活性,蛋白质印迹法检测大鼠肺组织中JAK2和p-STAT3的表达水平(灰度值)。结果正常组、溶剂组、模型组和抑制剂组的MPO活性分别为(0.13±0.06),(0.10±0.08),(0.44±0.11)和(0.28±0.07)U·g-1;这4组的JAK2蛋白的相对表达量分别为0.99±0.05,0.98±0.04,4.47±0.12和2.75±0.21;这4组的p-STAT3蛋白的相对表达量分别为1.00±0.06,0.99±0.08,4.82±0.25和2.83±0.16。上述指标:模型组与正常组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05);抑制剂组与模型组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05);正常组和溶剂组相比,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论在LIVI大鼠中,抑制JAK2/STAT3信号通路活性可有效降低大鼠肺组织内的炎性反应。

关键词：
作用机制
信号转导子与激活子3
呼吸机相关性肺损伤
炎性因子
肺损伤
蛋白酪氨酸激2
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肺组织渗透性水肿、炎性细胞大量浸润以及肺透明膜的形成是呼吸机相关性肺损伤(ventilator-induced lung injury,VILI)的主要病理改变[1]。VILI是导致机械通气患者死亡的主要原因。蛋白酪氨酸激2/信号转导子与激活子3(Janus kinase signal transducers 2 and activator of transcription 3,JAK2/STAT3)与VILI关系密切[2]。本实验研究抑制JAK2/STAT3信号通路活性对VILI大鼠肺组织内炎性反应的影响。

材料与方法

1、材料

动物8～10周龄Wistar雄性大鼠,体重200～220 g,购自大理药业股份有限公司。动物许可证号:SYXK(滇)2018-0001。

药品与试剂JAK2/STAT3信号通路抑制剂(AG490),规格:每支5 mg,纯度>99%,批号:GQY-1135P,购自南京建成生物有限公司。JAK2抗体和p-STAT3抗体,美国Santa公司生产;二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),购自南京建成生物有限公司。

仪器JSM23510LV电镜,加拿大Visual Sonics公司产品; LIOOS600T生物显微镜,日本尼康公司产品;凝胶成像系统,美国Bio-rad公司产品。

2、实验方法

2.1 VILI大鼠模型构建[3]3]

大鼠用10 %异氟烷麻醉后,在胸部气管处行纵切口(长度约为2 mm)插入自制气管导管机械通气量持续4 h,参数设置:VT=10 mL·kg-1, PEEP=3 cmH2O,RR=70次/分。建立VILI大鼠模型。

2.2分组与给药[4]4]

按照体重将模型大鼠随机分为2组:模型组、抑制剂组,每组10只;另取20只正常大鼠作为正常组和溶剂组。

造模前1 h,抑制剂组大鼠尾静脉注射AG490溶液10 mg·kg-1(将AG490溶解于DMSO中),溶剂组注射等剂量的DMSO,正常组和模型组注射等剂量的0.9%NaCl。

2.3支气管灌洗液(bronchial lavage fluid,BALF)标本采集并统计总细胞数和嗜中性粒细胞数

通气结束4 h后,处死大鼠,气管分离,参照文献[5]方法,用磷酸缓冲液5 mL冲洗左肺3次,收集BALF,回收率在80 %以上,以2000 r·min-1离心10 min,得上清,保存于-80℃。细胞沉淀经重悬后,均匀涂抹于载玻片上,用Wright Giemsa染液进行染色,在显微镜下观察并统计总细胞和嗜中性粒细胞的个数。

2.4主要检测指标

2.4.1计算各组大鼠肺组织湿重/干重比例[6]6]

大鼠处死后,开胸取左肺下叶,吸干肺组织表面血迹,称重(湿重W),然后置于烘箱中,设施温度60℃,连续烘干48 h,称重(干重D),计算W/D比值。

2.4.2以酶联免疫吸附法(enzyme linked immuno sorbent assay, ELISA)测定大鼠肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性[7]7]

称取大鼠50 %左肺上叶组织,研磨匀浆,37℃水浴15 min,用ELISA试剂盒法进行检测,在490 nm处检测OD值,根据OD值换算MPO活性。

2.4.3以蛋白质印迹法检测大鼠肺组织中JAK2和p-STAT3的表达水平[8]8]

取大鼠右下肺组织,研磨匀浆,裂解,离心得上清,测得蛋白浓度后,取50μg进行电泳、转膜和封闭,加入一抗(1∶1500),维持4℃过夜孕育,次日加入二抗(1∶10000),显色,以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(GAPDH)作为内参,计算蛋白的相对表达水平。

2.5次要检测指标

2.5.1以免疫组化检测大鼠肺组织中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的表达[9]9]

取大鼠右中肺组织,多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片,脱蜡,修复,3 %的双氧水浸泡,封闭,加稀释好的一抗,4℃过夜孵育,次日加入二抗,清洗,显色,苏木素轻度复染,干燥,封片,镜检,用图像分析系统进行统计分析。

2.5.2于电镜观察各组大鼠肺组织超微结构改变[10]10]

取大鼠右下肺组织,用2.5 %聚甲醛预固定15 min,1 %锇酸固定20 min,环氧树脂812浸透包埋切片,醋酸双氧铀和枸橼酸铅进行双重染色,制成切片,干燥,载与铜网上,于透射电镜观察超微病理结构。

3、统计学处理

数据分析用SPSS16.0软件,符合正态分布的计量资料以x¯±s表示,多组间比较用单因素方差分析,组间两两比较用独立t检验。

结果

1、各组大鼠肺组织W/D、MPO活性和BALF中嗜中性粒细胞、总细胞数量比较

模型组和正常组相比,W/D、MPO活性和BALF中嗜中性粒细胞、总细胞数量均明显升高,差异均有统计意义(均P<0.05);抑制剂组与模型组相比,上述指标的差异均有统计意义(均P<0.05);正常组和溶剂组相比,差异均无统计意义(均P>0.05),见表1。

表1各组大鼠肺组织的湿重/干重(W/D)、髓过氧化物酶(MPO)活性及支气管灌洗液(BALF)中嗜中性粒细胞、总细胞数量的比较

2、各组大鼠肺组织中JAK2和p-STAT3的表达比较

正常组、溶剂组、模型组和抑制剂组大鼠肺组织中JAK2蛋白相对表达量分别为0.99±0.05,0.98±0.04,4.47±0.12和2.75±0.21;这4组的p-STAT3蛋白相对表达量分别为1.00±0.06,0.99±0.08,4.82±0.25和2.83±0.16,模型组和正常组相比,JAK2和p-STAT3表达水平均显著增加,差异均有统计意义(均P<0.05);抑制剂组与模型组相比,上述指标的差异均有统计意义(均P<0.05);正常组和溶剂组相比,差异均无统计意义(均P>0.05)。

3、各组大鼠肺组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达比较

模型组和正常组相比,IL-1β、IL-6和TNF-α的表达均明显升高,差异均有统计意义(均P<0.05);抑制剂组与模型组相比,上述指标的差异均有统计意义(均P<0.05);正常组和溶剂组相比,差异均无统计意义(均P>0.05),见表2。

4、电镜观察各组大鼠肺组织超微结构改变

正常组和溶剂组大鼠的肺组织内肺泡壁清晰完整,且可见少量微绒毛,核膜完整,细胞内内容物皆清晰可辨,分布均匀;模型组大鼠的肺泡壁细胞膜不规则膨出,染色体呈现凝聚状态,细胞核膜界限清除,核膜固缩,细胞内容无出现不同程度的膨胀,重叠;与模型组相比,抑制剂组大鼠的细胞核膜形态较为正常,染色体分布清晰可辨,可见细胞表面微绒毛脱落,胞质内少量胶原纤维出现,见图1。

表2各组大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)含量的比较

图1电镜下观察各组大鼠肺组织超微结构改变

讨论

VILI作为机械通气的的不良反应之一,临床上以肺组织水肿和大量炎性细胞浸润和白细胞渗出为主要诊断标准。MPO活性的高低在一定程度上能够反映嗜中性粒细胞在肺组织的浸润、活化程度,也能反映肺部组织炎性受损的严重程度[11]。黄天丰等[12]研究表明,在内毒素性急性肺损伤小鼠模型中,阻断JAK2/STAT3通路的表达能降低IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。JAK2/STAT3信号通路是生物体内最重要的炎性通路之一,而IL-1β、IL-6和TNF-α是肺部组织中炎性反应的启动因子和效应因子。

本研究结果显示,VILI模型大鼠构建成功。同时,抑制剂组的炎性因子的表达明显降低(均P<0.05);而溶剂组与正常组相比,差异均无统计意义(均P >0.05),表明溶剂DMSO对自主呼吸大鼠的肺组织基本无影响。说明抑制JAK2/STAT3信号通路能够抑制LIVI大鼠肺组织内炎性反应。

参考文献：

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[5]阎玥,李春雷,史琦,等.温通方对支气管哮喘模型大鼠CCL5､IL-10调节作用的研究[J].中华中医药杂志,2018(6):2383-2386.

[6]林新,徐礼裕,李小华,等.微RNA-146a对机械通气大鼠肺损伤TLR4炎症信号通路的影响及机制[J].中华医学杂志,2018,98(34):2749-2753.

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[10]钟荣,肖军,戴春光,等.抑制c-Abl激酶调节桩蛋白酪氨酸磷酸化对通气损伤活体大鼠的保护效应[J].中华危重病急救医学,2017,29(7):596-601.

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唐慧洁,谭永丽,谭春晓,张凌云,刘思阳.蛋白酪氨酸激2/信号转导子与激活子3信号通路在大鼠呼吸机相关性肺损伤中的作用机制研究[J].中国临床药理学杂志,2020,36(16):2397-2400.