乳腺癌是威胁女性健康的常见恶性肿瘤。2018年流行病数据显示全球每年新诊断为乳腺癌的患者数量约139万,占女性新发恶性肿瘤总数的24.2%,发病率居女性恶性肿瘤首位;病死率占女性恶性肿瘤病死率的15%,每年病死人数约46万,居女性恶性肿瘤第2位[1,2]。乳腺癌逐年增长的发病率和死亡率,以及患病人群趋于年轻化,给家庭和社会带来沉重负担。中医对乳腺癌的认识历史久远,古籍称本病为“乳岩”“乳石痈”或者“石奶”等。《外科正宗》描述本病“初如豆大,渐若棋子……日后肿如堆栗,或如覆碗,色紫气秽,渐渐溃烂,深者如岩穴,凸者若泛莲”,形象地体现了乳腺癌不同阶段的疾病特点。

基于对乳腺癌的中医认识,本团队采用《金匮要略》中方剂“防己黄芪汤”对乳腺癌模型进行了干预研究。且前期斑马鱼实验研究表明,防己黄芪汤含药血清对乳腺癌上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)移植瘤的生长有显著抑制作用,能抑制移植瘤的血管新生及淋巴管新生,其主要机制可能与抑制Wnt通路蛋白表达有关[3]。为了进一步全面探索防己黄芪汤治疗乳腺癌的相关作用靶点及可能机制,本研究采用网络药理学分析方法,对防己黄芪汤抗乳腺癌的主要活性物质、作用靶点及信号通路进行了归纳分析,为防己黄芪汤应用于乳腺癌的治疗提供了更多依据。

1、资料与方法

1.1药物活性成分筛选

本研究依托中药系统药理学数据库与分析平台(TraditionalChineseMedicineSystemsPharmacologyDatabaseandAnalysisPlatform,TCMSP)以及中药整合数据库(TheTraditionalChineseMedicinesIntegratedDatabase,TCMID)获得了防己黄芪汤药物组成的已知的所有成分。通过口服生物利用度(oralbioavailability,OB)和类药性(drug-likeness,DL)对药物的相关活性成分进行筛选,以OB≥30%、DL≥0.18作为活性成分筛选标准。

1.2药物潜在作用靶点的预测

通过TCMSP平台查询化合物对应靶点,若化合物在平台中无靶点信息,则通过Pubchem数据库检索该成分相关小分子结构信息,以SMILES格式保存后,利用瑞士靶点预测(SwissTargetPrediction,STP)根据化学相似性找出靶点。通过Uniprot数据库标准化基因信息,并剔除无人类样本UniprotID的基因。

1.3乳腺癌相关靶点的收集

以“breastcancer”为检索词,通过人类孟德尔遗传数据库(OnlineMendelianInheritanceinMan,OMIM)以及GeneCards数据库检索得到的结果进行结合分析,构建乳腺癌靶点数据集。

1.4蛋白互作网络的构建

将防己黄芪汤中活性成分所对应的靶点与乳腺癌的疾病靶点取交集,所得靶点在STRING数据库中构建蛋白互作(protein-proteininteraction,PPI)图,进一步通过Cytoscape3.6.0软件拓扑分析。

1.5基因功能注释和通路富集分析

将匹配得到的靶点运用生物学信息注释数据库(TheDatabaseforAnnotation,Visualization,andIntegratedDiscovery,DAVID)进行靶点基因本体(geneontology,GO)生物学过程分析和京都基因与基因组百科全书(Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes,KEGG)信号通路富集分析,以P<0.05为筛选标准。

1.6体外实验验证

1.6.1材料

防己黄芪汤所含中药防己、生黄芪、白术、甘草、大枣、生姜均购于同仁堂饮片厂,制备防己黄芪汤干膏:取防己1.2kg、生黄芪1.5kg、白术0.9kg、甘草0.6kg、大枣0.6kg、生姜0.6kg,加入7倍量水,回流提取2次,静置、滤过提取液,浓缩后减压干燥成干膏,防己黄芪汤干膏1g相当于生药5.82g,将干膏粉碎成细粉后密封置于4℃冰箱中保存备用。人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购于北纳生物细胞库。胰蛋白酶、DMEM高糖培养基和胎牛血清(Gibco公司),MTT(四甲基偶氮唑盐,Sigma公司),FITCAnnexinV/PI双染试剂盒(BD公司)。

1.6.2细胞培养

将MDA-MB-231细胞培养于含10%胎牛血清、1%青-链霉素的DMEM培养基中,置于37℃、5%CO2恒温培养箱内培养,每2～3天传代一次。取对数生长期细胞用于实验。

1.6.3MTT法检测细胞增殖

将MDA-MB-231细胞接种于96孔板中,8×103个/孔,置于恒温37℃、5%CO2培养箱中,待细胞贴壁后,弃上清,加入防己黄芪汤溶液(0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/mL),每组6个复孔,并设置空白对照组。培养箱中继续培养48h后,每孔加入5mg/mLMTT溶液25μL,孵育4h后吸弃上清,再加入150μLDMSO,酶标仪490nm波长测定OD值。

1.6.4倒置显微镜观察细胞形态

将MDA-MB-231细胞接种于6孔板中,2×105个/孔,待细胞贴壁后,弃上清,加入防己黄芪汤溶液,继续培养24h、48h后使用倒置显微镜拍照。

1.6.5流式细胞术检测细胞凋亡

将对数生长期的MDA-MB-231细胞以1×105个/孔接种于6孔板,细胞贴壁后加入防己黄芪汤溶液,终体积为2mL。于24h、48h后收集细胞,加入5μLFITCAnnexinV和5μLPI,避光孵育15min,流式细胞仪上机检测。

1.7统计学分析

采用GraphPadPrism7软件对实验结果进行分析,数据以均数±标准差(x¯±s)表示,采用t检验分析实验组间的差异,P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1防己黄芪汤主要活性成分

以OB≥30%和DL≥0.18为条件对防己黄芪汤药物活性成分进行筛选后,得到防己的活性成分3个,黄芪20个,白术7个,甘草92个,生姜5个,大枣29个,剔除重复数据后剩余主要活性成分143个(按DL降序列出前25项,表1),构建药物-活性成分网络(图1)。

表1防己黄芪汤主要活性成分

2.2防己黄芪汤抗乳腺癌作用靶点

根据TCMSP数据库中的活性成分靶点信息,并结合STP靶点预测结果,共收集到中药活性成分的相关作用靶点共118个。通过检索GeneCards和OMIM数据库,整合后得到乳腺癌靶点14645个。将药物相关靶点与疾病相关靶点进行匹配,得到108个防己黄芪汤抗乳腺癌的可能作用靶点(图2),进一步构建活性成分-疾病靶点网络(图3)。在108个活性成分中,根据“中介中心性”(betweenness)降序排列,前5位有效成分分别是槲皮素(quercetin,MOL000098)、山奈酚(kaempferol,MOL000422)、异鼠李素(isorhamnetin,MOL000354)、柚皮素(naringenin,MOL004328)和甘草查尔酮A(licochalconea,MOL000497)。

图1防己黄芪汤药物-活性成分网络

图2Venn图

2.3蛋白互作分析

在STRING数据库中构建上述108个靶点的PPI网络(图4)。此网络共包含108个节点,1035条边。按连接节点数量对靶点进行排序(图5),筛选后得到的核心靶点包括:白细胞介素6(interleukin6,IL-6)、血清白蛋白(serumalbumin,ALB)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase3,CASP3)、血管内皮生长因子A(vascularendothelialgrowthfactorA,VEGFA)以及表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)等。

2.4GO和KEGG通路富集分析

研究对108个靶点进行富集分析,GO功能分析以P<0.05为筛选标准,得到与乳腺癌相关的生物学过程118条,包括:DNA结合转录激活因子活性、RNA聚合酶Ⅱ特异性(GO:0001228)、泛素样蛋白连接酶结合(GO:0044389)、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合(GO:0001085)、泛素蛋白连接酶结合(GO:0031625)、核受体活性(GO:0004879)等(图6)。为了进一步揭示防己黄芪汤抗乳腺癌的作用机制,研究以P<0.05为筛选标准对108个靶点进行KEGG通路富集分析,筛选获得KEGG通路113条,包括:细胞凋亡(hsa04151)、TNF信号通路(hsa04668)、乳腺癌通路(hsa05224)、多途径细胞凋亡(hsa04215)等(图7-8)。

图3活性成分-疾病靶点网络

2.5体外实验结果

2.5.1防己黄芪汤对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响

MTT结果显示,随着药物浓度的增加,防己黄芪汤对MDA-MB-231细胞的抑制作用逐渐增强,48h的IC50值为1.749mg/mL(图9)。

2.5.2防己黄芪汤对乳腺癌MDA-MB-231细胞形态的影响

以1.8mg/mL防己黄芪汤作用于MDA-MB-231细胞24h、48h后,细胞的萎缩加剧,纤维变短,部分细胞开始簇集成团,细胞折光性增加,悬浮细胞明显增多(图10)。

2.5.3防己黄芪汤对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响

与MDA-MB-231细胞常规培养48h相比,1.8mg/mL防己黄芪汤作用于细胞48h后,细胞凋亡率显著增加(图11)。

3、讨论

防己黄芪汤由防己、黄芪、白术、甘草、生姜、大枣六味药组成,《金匮要略》原文中主治“风湿,脉浮身重,汗出恶风”,全方具有益气固表、祛风除湿的功效。目前防己黄芪汤在乳腺癌相关治疗中的应用广泛,研究发现防己黄芪汤治疗乳腺癌术后淋巴水肿具有良好的疗效,能减轻患肢肿胀程度,缩小患侧上肢近端部位的周径,改善患肢疼痛症状,治疗组总有效率(85.71%)明显优于对照组(53.03%)[4]。与呋塞米治疗相比,防己黄芪汤治疗淋巴水肿在保证疗效的同时,具有更低的不良反应发生率(防己黄芪汤组2.33%,呋塞米组16.28%)[5]。另外,防己黄芪汤能改善乳腺癌患者的免疫功能,治疗后患者CD4+水平以及CD4+/CD8+比值明显高于治疗前(P<0.05),IL-17和Th17的水平较治疗前降低(P<0.05)[6]。这些研究体现了防己黄芪汤在治疗乳腺癌及其并发症方面的应用价值。本文在前期研究的基础上,进一步通过网络药理学的方法探索防己黄芪汤治疗乳腺癌的靶点和作用机制,为本方的临床应用提供更多证据支持。

通过本研究发现,防己黄芪汤治疗乳腺癌的有效成分包括槲皮素、山奈酚、异鼠李素、柚皮素、甘草查尔酮A等。槲皮素具有抑制细胞周期的作用,能下调CyclinD1、p21蛋白表达,将乳腺癌MCF-7细胞阻滞于G1期;也能通过下调Twist和MAPK通路蛋白的表达,诱导乳腺癌细胞凋亡[7]。山奈酚能下调GSK-3β磷酸化水平,使乳腺癌对化疗药物增敏;通过下调PI3K、Akt等蛋白表达来诱导乳腺癌SUM190细胞凋亡[8]。异鼠李素具有抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭的作用,其机制与降低p38、STAT3磷酸化水平,下调MMP-9和MMP-2的蛋白表达相关[9]。柚皮素能调控EGFR、p38、ERK1/2、JNK等蛋白磷酸化水平,降低MAPKs-AP-1和IKKs-IκB-NF-κB信号通路之间的协同作用,从而减弱乳腺癌的细胞活性[10]。甘草查尔酮A与肿瘤凋亡密切相关,能活化caspase3和caspase9蛋白,降低Bcl-2表达,使细胞色素C从线粒体释放到细胞质中,诱导细胞凋亡;通过调节E-cadherin和波形蛋白表达,有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移和侵袭[11]。

图4PPI网络图

图5防己黄芪汤治疗乳腺癌核心靶点

蛋白互作分析发现,防己黄芪汤治疗乳腺癌的核心蛋白包括IL-6、ALB、CASP3、VEGFA、EGFR等。白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)能促进炎症介质释放及诱导肿瘤发生,过表达IL-6能使乳腺癌T47D细胞侵袭和转移能力增强[12]。白蛋白(albumin,ALB)与肿瘤分期、淋巴结转移情况关联密切,血清ALB可能通过免疫系统影响肿瘤分期和转移,从而影响肿瘤预后[13]。CASP3是细胞凋亡的核心蛋白之一,激活的CASP3能切断PARP等再激活核酸内切酶,使DNA在核小体单位之间的连接处断裂,从而促进乳腺癌细胞凋亡[14]。VEGFA是血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)家族成员之一,肿瘤细胞分泌VEGFA有助于新生血管形成,从而促进癌症的发生发展[15]。EGFR是表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)信号传导的受体,在乳腺癌中异常表达,负责调控细胞分裂以及血管形成[16,17]。综上可知,防己黄芪汤能够通过促进乳腺癌细胞凋亡、抑制增殖、抗血管生成等机制抑制乳腺癌发生发展。

图6防己黄芪汤治疗乳腺癌GO分析

图7防己黄芪汤诱导乳腺癌细胞凋亡通路分析

GO富集和KEGG通路分析结果提示,防己黄芪汤主要参与基因转录、蛋白连接等生物功能,作用于细胞凋亡相关通路,发挥对乳腺癌的抑制作用。防己黄芪汤诱导乳腺癌细胞凋亡发生的途径与线粒体凋亡途径及死亡受体途径密切相关:①线粒体凋亡途径:线粒体膜电位下降,线粒体内促凋亡因子释放到胞质中,形成凋亡复合体,激活pro-caspase9而形成caspase9全酶,进一步激活caspase3和caspase7,启动caspase级联反应,切割细胞中PARPA等多种底物,导致细胞凋亡[18]。②死亡受体途径:肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)三聚体与TNFR1结合后可募集TRAF2、FADD等信号分子,TRAF2激活IκB激酶(IκBkinase,IKK)后磷酸化IκB,释放NF-κB,激活抗凋亡基因Bcl-XL等表达,促进细胞生存;FADD可以激活caspase8,引发caspase级联反应介导细胞凋亡[19]。上述分析表明防己黄芪汤主要通过细胞凋亡途径抗乳腺癌。本研究通过体外实验进一步验证防己黄芪汤的作用,流式结果表明,防己黄芪汤能促进乳腺癌细胞MDA-MB-231发生凋亡,这也验证了KEGG分析的结果。

图8防己黄芪汤治疗乳腺癌KEGG分析

图9防己黄芪汤对MDA-MB-231细胞增殖的抑制率

图10防己黄芪汤作用0h(A)、24h(B)、48h(C)后对MDA-MB-231细胞形态的影响

图11防己黄芪汤诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞发生凋亡

综上可知,防己黄芪汤在乳腺癌的治疗上具有潜在的应用价值。该方可能通过不同靶点、不同信号通路之间的相互作用,共同达到治疗的目的。本研究初步验证了防己黄芪汤促进乳腺癌细胞凋亡的作用,而今后的研究可进一步围绕通路及蛋白分析结果进行深入探索,为防己黄芪汤治疗乳腺癌提供更多证据支持,为临床应用提供更多科学依据。

参考文献：

[4]李晶洁,邢铁艳.防己黄芪汤加减治疗乳腺癌术后患肢水肿的疗效观察[J].陕西中医,2016,37(07):806-807.

[5]汤敏.防己黄芪汤加减治疗乳腺癌术后患肢水肿的临床价值研究[J].内蒙古中医药,2018,37(08):3-4.

[6]王伟,孔刘明,姜明强.防己黄芪汤对乳腺癌术后水肿及免疫的影响[J].世界中医药,2018,13(05):1119-1122.

[8]赵明智,张磊,周丹,等.山奈酚调控PI3K/AKT/GSK-3β信号通路促进人炎性乳腺癌SUM190细胞株凋亡的研究[J].广西医科大学学报,2019,36(6):872-877.

[12]杨毅,张洁,王智勇,等.SHP2介导IL-6促进乳腺癌细胞侵袭作用机制的研究[J].中国肿瘤临床,2016,43(18):792-796.

[14]董奕裕,黄晓文,李建兰.Talin2通过Caspase3信号通路调控乳腺癌细胞侵袭[J].实用医学杂志,2020,36(03):311-316.

[15]刘黎,董华琼,张匠,等.miRNA-613靶向VEGFA调控乳腺癌细胞吉西他滨耐药性的机制研究[J].癌症进展,2019,17(13):1551-1556.

刘宇飞,樊英怡,余红,郭鱼波,于博文,王春晖,裴晓华.基于网络药理学的防己黄芪汤治疗乳腺癌机制探讨[J].现代肿瘤医学,2021,29(07):1139-1147.

基金:国家自然科学基金面上项目(编号:81774319)