新型冠状病毒肺炎具有潜伏期长、传染性强、各类人群普遍易感特点，对全球人民健康、经济发展和社会稳定带来巨大负面影响。世界卫生组织宣布将COVID-19全球风险等级提至最高级别[1]。治疗COVID-19至今尚无针对性的有效药物，临床治疗以对症、支持疗法为主。如何形成快速有效的救治方案，是当前面临的重大问题。国家卫生健康委员会先后印发了7版《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》[2]，各省市自治区也结合地域特点，先后出台了各自的诊疗方案，在这些诊疗方案中，推荐采用中医药方剂进行COVID-19的治疗及预防。其中，在《上海市新型冠状病毒肺炎中医诊疗方案（试行第二版）》[3]、《广东省新型冠状病毒肺炎中医诊疗方案（试行第二版）》[4]中，将清热解毒类中成药痰热清胶囊推荐用于COVID-19轻型患者。

痰热清胶囊由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘5味药材组成，具有清热、化痰、解毒的功效，用于风温肺热病属风热袭肺证，症见发热、恶风、咳嗽、咯痰或咽痛、流涕、口干等[5]。痰热清胶囊中的黄芩为君药，具有清热燥湿、泻火清毒之功效；熊胆粉、山羊角为臣药，熊胆粉具有清热、平肝、明目作用；山羊角具有清热镇惊、平肝熄风、散瘀止痛的功效；金银花为佐药，有广谱抗菌作用，以助清热解毒、宣肺化痰；连翘为使药，具有升浮宣散之力。目前针对痰热清胶囊作用机制的研究报道较少，其用于治疗COVID-19的机制研究尚未见报道。由于中药复方具有多成分、多靶点及协同作用的特点，传统药理学研究手段存在一定的局限性，而网络药理学是系统生物学和多向药理学相融合而成，强调药物作用特点是干预疾病网络，其理念与中药复方的作用特点具有一致性，为中药复方的机制研究提供了新的策略[6]。因此，本研究借助Swiss Target Prediction服务器、TCMSP数据库获取痰热清胶囊中主要化合物的作用靶点，然后利用String10、Omicsbean等在线分析平台进行通路富集分析和生物信息学分析，从网络药理学角度，阐释痰热清胶囊多成分、多靶点、多途径发挥清热、化痰、解毒功效的科学内涵，为其治疗COVID-19的临床应用提供参考，同时为其进一步的作用机制研究奠定基础。

1、材料

ChemBio-Office-2010；Swiss-Target-Prediction服务器；中药系统药理学数据库与分析平台；UNIPROT数据库；京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路数据库；STRING10数据库；DAVID数据库；Omicsbean在线分析软件；Omicshare Tools在线制图软件；Cytoscape3.6.1软件。

2、方法

2.1 目标化合物的选取

痰热清胶囊由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘5味药材提取制成，以课题组前期化学物质组研究结果为基础，结合该方的功能主治、药味作用特点以及制备工艺、成分含量等方面，选取了来源于5味药材中的黄酮类、木脂素类、苯乙醇苷类、有机酸类、氨基酸类、胆汁酸类19个化合物为研究对象，具体信息见表1。

表1  痰热清胶囊中19个化合物信息

2.2 目标化合物靶点的预测分析

登录Swiss Target Prediction服务器，在线绘制痰热清胶囊19个化合物的化学结构，采用反向药效团匹配方法得到虚拟匹配筛选结果。同时在TCMSP数据库检索，获取化合物的相关靶点信息。由于检索到的药物靶标存在命名不规范等问题，因此，本实验使用UniProt数据库中Uni Prot KB搜索功能，通过输入蛋白名称并限定物种为“human”，将检索得到的所有蛋白校正为其官方名称。整合Swiss Target Prediction和TCMSP靶点结果，得到化合物潜在作用靶点库。

2.3 通路分析及生物信息学分析

运用Omicsbean软件对靶点蛋白进行生物信息学分析，探究靶点蛋白在细胞组分、分子功能以及生物过程方面的作用机制。通过STRING10数据库得到与靶点相关的通路过程，利用KEGG数据库以及查阅相关文献，对得到的通路进行深入分析。

2.4 构建蛋白互作网络（PPI）及筛选关键蛋白靶点

将整合的靶点信息导入STRING10数据库中，物种限定为“Homosapiens”，获得蛋白间相互作用信息，将文件导入Cytoscape3.6.1软件中绘制PPI网络，分析其网络拓扑参数，筛选出关键蛋白靶点。

2.5 “化合物-靶点-通路-药理作用-功效”网络构建

根据上述痰热清胶囊19个化学成分的靶点及通路预测结果，在Excel表格中建立化合物-靶点、靶点-通路、通路-药理作用、药理作用-功效的相互对应关系，然后导入Cytoscape3.6.1软件中构建网络，并运用其插件Network Analyzer计算网络的特征。网络中节点（node）表示化合物、靶点以及作用通路、药理作用、功效。边（edge）表示化合物靶点，靶点-通路以及靶点-药理作用、药理作用-功效相互作用。经处理后，得到19个成分的相关靶点、通路预测图，以该图来表示痰热清胶囊“化合物靶点-作用通路-药理作用-功效”之间的相互关系。

3、结果

3.1 化合物潜在靶点分析结果

通过Swiss Target Prediction服务器反向对接实验和TCMSP数据库检索，得到19个化合物共163个相关靶点，导入STRING10数据库中得到PPI网络，该网络有163个节点，901条边，其中节点代表靶点，边代表靶点之间的相互作用关系。利用Cytoscape3.6.1软件将PPI网络可视化（图1），并进行网络拓扑分析，根据节点的度值≥20筛选出关键靶点，包括TNF、EGFR、NOS3、PTGS2、APP、JUN、HRAS、REN、MMP2、MAPK14、VCAM1等23个（表2），这些蛋白涉及炎症反应、免疫调节、抗菌、抗病毒、解热、止痛、镇静、化痰、镇咳平喘等方面，提示痰热清胶囊清热、化痰、解毒功效机制可能与这些蛋白靶点有关。

表2  痰热清胶囊相关核心蛋白靶点信息

图1  痰热清胶囊相关蛋白靶点的PPI网络

为了进一步了解PPI网络的生物作用，使用Cytoscape3.6.1的MCODE插件对网络进行Cluster模块分析，共获得8个Cluster模块，结果见图2，具体模块信息见表3。对8个模块分别进行GO分析，发现Cluster1主要与平滑肌收缩的调节、免疫应答调节、调节血管收缩、胆碱能突触传递等生物过程有关；Cluster2主要与正调控发热的产生、免疫应答、调节NO的生物合成等通路过程有关；Cluster3主要与刺激神经组织的配体-受体相互作用、谷氨酸能突触、全身性红斑狼疮等通路过程有关；Cluster4主要与炎症反应、抗氧化应激、镇静等生物过程有关；Cluster5主要与花生四烯酸分泌与代谢、脂氧合酶途径、脂质分解代谢等生物过程有关；Cluster6主要与免疫炎症过程、脂质代谢、蛋白质代谢等生物过程有关；Cluster7主要与刺激神经组织的配体-受体相互作用、血管平滑肌收缩等通路过程有关；Cluster8主要与氨基酸的合成与代谢有关。

图2  痰热清胶囊相关蛋白靶点的Cluster模块的PPI网络

表3  痰热清胶囊相关蛋白靶点的PPI网络Cluster数据

3.2 生物信息学分析

利用Omics Bean分析软件对相关靶点蛋白进行功能注释分析（GO分析），包含细胞组分、分子功能和生物过程3个方面，选取P值最小的前10个进行作图呈现（图3）。结果发现，这些蛋白在生物过程方面主要涉及白细胞活化参与的炎症反应、内源性刺激反应、外源性刺激反应等过程；细胞组分方面主要参与谷氨酸能突触、树突树结构、细胞外间隙等过程；在分子功能方面主要参与蛋白结合绑定、酶结合、药物结合等过程。推测痰热清胶囊清热化痰解毒功效可能与以上功能过程相关。

图3  痰热清胶囊相关蛋白靶点的GO富集分析

3.3 通路分析

在STRING10数据库中得到106条通路（false discovery rate＜0.01），对其进行KEGG分析及相关文献查阅，得到68条相关信号通路，具体信息见表4，通过Omicshare在线平台对false discovery rate（FDR）值前20的通路进行可视化处理（图4），其中rich factor表示相关基因中位于该通路的基因数目与所有注释基因中位于该通路的基因总数的比值，该值越大代表富集程度越高。

表4  68条富集通路信息

图4  痰热清胶囊相关蛋白靶点KEGG通路富集分析的前20条通路

分析富集的通路发现，主要涉及与炎症免疫相关的通路，如花生四烯酸代谢、白介素17信号通路肿瘤坏死因子α信号通路等；与解热止痛相关的通路，如环磷酸腺苷信号通路、钙信号通路等；与化痰镇咳平喘相关的通路，如环磷酸鸟苷-蛋白激酶G信号通路、cAMP signaling pathway等；与镇静相关的通路，如神经活性配体受体相互作用等。

3.4 “化合物-靶点-通路-药理作用-功效”网络构建与拓扑学属性分析

根据对应关系在Cytoscape3.6.1软件中，构建“化合物-靶点-通路-药理作用-功效”的网络关系图（图5）通过拓扑属性分析发现，该网络有67340条边，且构建网络的节点度分布服从幂分布［P(x)＝106.67×x−1.275（r2＝0.81）]，表明痰热清胶囊网络为无标度网络。特征路径长度3.331，即网络路径长度为3步，大多数蛋白的联系非常密切，表明该网络具有较快的传播速度和较小的反应时间，具有小世界性质。网络异质性为0.883，平均相邻节点数目7.169，网络中心度0.155。提示痰热清胶囊网络具有无标度、小范围的体系结构。分析发现，网络中既存在一个分子与多个靶点蛋白的相互作用，也存在不同分子作用于同一个靶点蛋白的现象，显示了痰热清胶囊的多成分、多靶点、多通路的作用特点，初步阐释了痰热清胶囊清热、化痰、解毒药效物质基础和作用机制。

图5  痰热清胶囊“化合物-靶点-通路-药理作用-功效”网络

4、讨论

本实验通过网络药理学手段探讨痰热清胶囊治疗COVID-19的作用机制，结果发现，痰热清胶囊可通过干预与抗炎、免疫调节、解热、止痛、化痰、镇咳平喘、抗菌、抗病毒等相关的蛋白及通路发挥治疗作用。

4.1 抗炎及免疫调节作用

COVID-19通过作用于呼吸道和肺部细胞上的ACE2受体，经受体介导的内吞作用进入细胞，导致细胞因子释放及肺部炎症，感染导致的“细胞因子风暴”会进一步加重炎症反应[7]。临床研究显示，COVID-19患者的淋巴细胞计数显著降低，中性粒细胞异常增多，同时伴随着细胞因子大量累积[8]，如TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、趋化因子10（IP10）、人单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等[7]。IL-2的主要生物学功能是促进T细胞的增殖与分化，同时又可限制T细胞反应增强机体免疫耐受[9]。TNF-α是细胞因子网络的启动因子，能诱导其他细胞因子如IL-6、IL-1β等的释放，共同对组织造成损伤[10]。IL-6是造成细胞因子风暴的典型促炎因子[11]。

本实验发现，野黄芩苷、黄芩苷、千层纸素-7-O葡萄糖醛酸苷、连翘酯苷D可作用于IL-2和TNF-α；连翘酯苷E、鹅去氧胆酸、千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、赖氨酸、甘氨酸可分别通过干预HRAS、JUN和VCAM1、MAPK14、PTPRC、PLA2G2A和LTA4H调节与炎症和免疫相关的信号通路，如花生四烯酸代谢、PI3K-Akt、MAPK、TNF、T细胞受体、IL-17信号通路等。另外，山羊角中含有的多种功能性氨基酸在T细胞活化中发挥重要作用，如精氨酸[12]、亮氨酸[13]可促进T细胞的分化成熟。

4.2 解热止痛作用

发热是COVID-19进展过程中重要的临床表现之一，当外源性致热原进入机体作用于免疫活性细胞，产生内源性致热原，包括IL-1β、IL-6、IL-10、TNF等。这些细胞因子直接或间接通过中枢正调节介质PGE2等作用于体温调节中枢，体温调定点上移，引起产热增加，散热减少，使体温升高[14]。同时，这些致热性细胞因子也可通过增加神经元和胶质细胞上PGE2的表达水平参与外周敏化[15]，从而在持续性痛或病理性痛中起到关键性作用。

网络药理研究结果表明，野黄芩苷[16]、黄芩苷[17]、千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、绿原酸[18]、咖啡酸[19]、鹅去氧胆酸、甘氨酸[20]、缬氨酸[21]、酪氨酸可作用于前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）；白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、咖啡酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸可作用于PTGS1，从而减少前列腺素生成。熊去氧胆酸可作用于前列腺素EP2受体（PTGER2），参与inflammatory-mediator-regulation-of-TRP channels和AMP信号通路来发挥解热止痛作用。

4.3 化痰及镇咳作用

COVID-19会造成气道黏液高分泌[22]，致使本已严重障碍的通气功能更加受损，成为患者病情恶化的促动因素[23]。气道黏液中高度糖基化的高分子量黏蛋白是气道黏液的最主要成分[24]，其表达和分泌受细胞因子的正性调节，如IL-1β、IL-4、IL-13、TNF-α、EGF等[25-29]。本实验发现，痰热清胶囊中黄芩苷、连翘酯苷E、熊去氧胆酸等多个化合物可通过干预cAMP、PI3K-Akt等多条信号通路调节细胞因子的高表达，减少气道黏液分泌。另外，气道黏膜有丰富的副交感神经（胆碱能），其激动后可使黏液和浆液细胞的释放均增加[30]。网络药理结果表明，野黄芩苷、黄芩苷[31]、千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷可作用于乙酰胆碱酯酶（AchE），促进乙酰胆碱降解，影响胆碱能受体活性，抑制气道黏液分泌。白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、咖啡酸、酪氨酸、亮氨酸亦可与ADRB2结合，推测可能为β2受体的潜在激动剂，通过激活该受体在一定程度上发挥止咳作用。

4.4 抗菌、抗病毒作用

已有文献表明，痰热清胶囊能显著降低流感病毒FM1感染小鼠的肺指数，明显降低小鼠死亡率[32]，且对上呼吸道感染的包括金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、流感杆菌等在内的9种细菌有显著的抗菌活性[33]。本实验网络药理学结果发现，痰热清胶囊中的野黄芩苷、黄芩苷、千层纸素-O-葡萄糖醛酸苷、咖啡酸、鹅去氧胆酸、连翘酯苷D等可作用于EGFR、PLG、PTGS2、JUN、MAPK14等蛋白干预由细菌或病毒引起的多种疾病信号通路。如：百日咳、丙型肝炎、甲型流感、肺结核等。由此提示，痰热清胶囊对COVID-19有潜在治疗作用。

4.5 镇静作用

COVID-19患者在治疗过程中往往会感到焦虑，影响到自身的睡眠及身体的恢复，有研究表明[34]，睡眠时人体的免疫系统能够得到某种程度上的修复和提升。本实验网络药理实验发现，熊去氧胆酸、赖氨酸和甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸可分别作用于中枢神经系统内主要抑制性受体-γ氨基丁酸受体（GABA）[35]的两个亚型GABBR1、GABRA1，干预Neuroactive-ligand-receptor-interaction信号通路发挥镇静催眠作用。

综上，痰热清胶囊可通过多成分、多靶点、多通路的共同作用治疗COVID-19。但鉴于网络药理学的局限性，后期还将对关键靶点及通路进行验证实验，以期为痰热清胶囊治疗COVID-19提供更充足的实验依据。

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