摘要:目的:探讨泛素结合酶10(Ubch10)在脑胶质瘤细胞中的表达及临床意义。方法:选取2017年7月至2019年3月祁阳县人民医院收治的56例脑胶质瘤患者脑组织作为研究对象,同期选取10例正常冻存脑组织作为对照组,采用免疫组化检测脑胶质瘤细胞组织及正常组织中UbcH10含量,分析以siRNA干扰U251细胞中UbcH10表达情况,将siRNA试剂干扰后脑胶质瘤组织纳入干扰组,通过记录shRNA干扰后UbcH10表达量,分析Rb磷酸化水平与UbcH10的关系。结果:UbcH10表达量与肿瘤直径、组织学分级、浸润深度、Ki-67表达量、肿瘤转移和生存情况相关,差异均有统计学意义(P<0.05)。siRNA干扰后,干扰组UbcH10及p-Rb表达量显著低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。脑胶质瘤组织中UbcH10水平(0.91±0.09)较正常组织(0.48±0.10)升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:UbcH10在脑胶质瘤细胞中表达水平较高,并且其表达水平与调控Rb蛋白释放有关,其在脑胶质瘤的发生和发展中起到关键性作用。
脑胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤,具有生存期短、死亡率高、侵袭性强和易复发等特点。据文献报道,世界卫生组织(WHO)根据恶性程度(Ⅰ~Ⅳ级)将其分为Ⅲ~Ⅳ级的高级别脑胶质瘤和Ⅰ~Ⅱ级的低级别脑胶质瘤,其中高级别胶质瘤占75%左右,而低级别胶质瘤也可能演变为高级别恶性胶质瘤,但由于其发生发展和演变过程极其复杂,因此,明确影响其恶性程度的关键因子对治疗该病具有重要意义[1]。泛素结合酶10(UbcH10)是一种细胞周期蛋白,参与调控细胞的有丝分裂[2]。研究表明,UbcH10可特异性降解泛素化底物,在肿瘤的发生及发展过程中具有重要作用[3]。基于此,本研究探讨脑胶质瘤细胞中Ubch10表达及其临床意义,期望为脑胶质瘤诊疗以及预后评估提供新思路。
1、资料与方法
1.1一般资料
选取2017年7月至2019年3月祁阳县人民医院收治的56例脑胶质瘤患者脑组织作为研究对象,选取同期10例正常冻存脑组织为对照组,所有样本均经2位以上病理学医师诊断并确诊。其中脑胶质瘤组织来源患者男26例,女30例;年龄40~70岁,平均(58.64±5.67)岁;毛细胞型星形胶质细胞瘤29例,胶质母细胞瘤14例,间变性星形胶质细胞瘤13例。
1.2试剂与方法
1.2.1试剂
鼠抗人UbcH10抗体、Rb相关抗体试剂盒、超敏链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(SP)试剂盒、鼠抗人Ki-67抗体均购自上海煊翎生物科技有限公司。
1.2.2检测方法
(1)UbcH10蛋白表达的检测:采用免疫组化方法测定UbcH10蛋白表达,脑胶质瘤细胞组织及正常组织切成厚度为4μm的薄片,展片、烤干,脱蜡水化,使用柠檬酸盐缓冲液修复抗原,H2O2孵育,磷酸盐缓冲液冲洗后,取出过氧化物酶,加入Ki-67抗体4℃孵育过夜,再次磷酸盐缓冲液冲洗后,加入二抗,采用SP法进行染色,抗体稀释比例参考说明书建议。染色切片图像使用MC-IDEvaluation7.0图像分析系统分析,随机取5个棕黄色(阳性染色)的视野区,确定标本的阳性染色率,阳性细胞率=阳性染色细胞数目/视野区总细胞数目,取5个视野区的平均值进行分析。(2)UbcH10基因的siRNA序列设计、合成和转染:检索UbcH10基因编码序列区域数据信息,应用siRNA序列序列设计软件构建相应siRNA序列,合成互补双联siR-NA。采用UbcH10-siRNA转染48h,过程严格按照Lipofectmaine2000说明书进行siRNA转染操作。将siRNA试剂干扰后脑胶质瘤组织纳入干扰组。(3)siR-NA干扰后Rb蛋白磷酸化结果检测:取对数生长期细胞,将细胞悬液接种于培养皿中,4ml细胞悬液接种于6cm培养皿中,1d后使用无血清培养稀释携带siRNA的质粒及转染试剂加入细胞中,孵育15min后形成复合物并加入细胞中,6h后换液,2d后检测细胞。
1.3观察指标
对免疫组化结果进行判定,依据阳性细胞率和染色强度对评分进行综合判断。阳性细胞率≥75%记为3分,阳性细胞率在50%~75%记为2分,阳性细胞率在25%~49%记为1分,阳性细胞率<25%记为0分;染色强度:无染色为0分,染色图呈浅棕色为1分,染色图可见明显棕色为2分,染色图可见明显深棕色为3分,两项评分结果相乘作为UbcH10表达总分,UbcH10表达总分<5分为低表达,≥5分为高表达。
1.4统计学方法
应用SPSS22.0统计分析软件处理数据,符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用t检验;计数资料以例(%)表示,组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1UbcH10表达水平与一般资料及病理特征的关系
UbcH10表达水平与患者年龄和性别无关(P>0.05);UbcH10表达水平与肿瘤直径、组织学分级、浸润深度、Ki-67表达量、肿瘤转移和生存情况相关(P<0.01)。见表1、表2。
表1UbcH10表达水平与一般资料的关系[例(%)]
2.2shRNA干扰后Rb蛋白磷酸化结果
siRNA干扰后,干扰组UbcH10及p-Rb表达量显著低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。
2.3UbcH10在脑胶质瘤组织及正常组织中的表达情况
脑胶质瘤组织中UbcH10水平(0.91±0.09)较正常组织(0.48±0.10)升高,差异有统计学意义(t=22.37,P<0.01)。
表2UbcH10表达水平与病理特征的关系[例(%)]
表3干扰组和对照组干扰后UbcH10和p-Rb水平比较
3、讨论
脑胶质瘤恶性程度高且预后不良,一直是神经外科的重点和难点。依照WHO病理分类标准,可将胶质细胞瘤分为间变性星形胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤及毛细胞型星形细胞瘤[4]。临床以胶质母细胞瘤最为常见,恶性程度高且预后不良,目前临床治疗主要以放疗、化疗和手术切除为主,但是预后较差。星形胶质细胞瘤浸润性强,由于其与周围组织界限不清,因此,手术无法完全切除,导致术后有较高的复发情况。毛细胞型星形胶质细胞瘤多发于儿童与青年人群,虽然其可经手术完全切除,仍难以有效提高患者的生存时间。WHO病理分级方法主要依靠形态学观察,临床应用仍存在明显不足及局限性,判断其分化过程、与转移瘤的鉴别日益受到人们的重视。
UbcH10是泛素化蛋白降解中的关键成员,其可激活泛素分子后转移至活化酶,将底物泛素化。研究发现,UbcH10水平上调影响多种来源肿瘤细胞的发展过程,因此,通过抑制其表达对调控细胞增殖具有重要作用[5]。据相关文献显示,在多种癌中均可见明显的UbcH10高表达,因此,其在肿瘤发生及发展过程中起到十分重要的角色[6]。基于此,本研究旨在揭示UbcH10在胶质瘤中的功能角色及表达。
本研究结果显示,脑胶质瘤组织中UbcH10水平较正常组织更高,其表达量与肿瘤直径、组织学分级、浸润深度、Ki-67表达量、肿瘤转移和生存情况相关,这证实了UbcH10表达影响脑胶质瘤的发生及发展,有效抑制其表达是治疗脑胶质瘤的关键所在。研究表明,Rb蛋白是公认的抑癌蛋白,能有效减少癌基因表达、转录,但当磷酸化Rb蛋白失活后,会加速细胞周期进程,增强细胞增殖能力[6]。有学者指出,在脑胶质瘤细胞中,UbcH10可磷酸化Rb蛋白[7]。本研究结果显示,shRNA干扰后,UbcH10及p-Rb表达量显著低于对照组。这说明UbcH10能调控Rb蛋白,有效促进转移。
综上所述,UbcH10在在脑胶质瘤细胞中表达水平较高,其表达水平与调控Rb蛋白释放有关,说明其在脑胶质瘤的发生和发展中起到关键性的作用。但由于本研究样本小,还需要进一步研究。
参考文献:
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