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马尾松松针提取物对阿尔茨海默病小鼠认知功能的作用机制

2024-07-18 11 上传者：管理员

摘要：为研究马尾松松针提取物（PNE）对阿尔茨海默病（AD）小鼠模型认知功能的作用及机制，实验中将50只健康小鼠分成对照组、模型组、PNE低剂量组、PNE中剂量组和PNE高剂量组，用D-半乳糖和AlCl3诱导小鼠建立AD模型，造模同时用PNE（200、400、800 mg/kg）进行灌胃干预.采用跳台实验方法检测小鼠行为学的改变；生物显微技术观察海马组织结构的变化；比色法检测海马组织中SOD、CAT、GPx活性及MDA;ELISA法测定海马组织炎症相关因子白细胞介素IL-4及IL-6含量；Western blotting检测海马组织中APP、Aβ42、tau和MAP2蛋白含量.结果显示，D-半乳糖和AlCl3诱导的AD小鼠模型中，PNE明显延长了AD小鼠的逃避潜伏期，降低了错误次数；改善了小鼠海马CA1区的病理改变；增加了海马组织中SOD、CAT、GPx活性及IL-4含量；降低了海马组织中MDA、IL-6含量；下调了APP、Aβ42和tau蛋白表达；上调了MAP2蛋白表达.结论：PNE对AD模型小鼠的认知功能具有改善作用，其机制可能与提高抗氧化酶系活性，抑制脑内炎症反应，降低APP、Aβ42和tau表达，促进MAP2表达，减少Aβ的沉积有关.

关键词：
β-淀粉样蛋白
微管相关蛋白
认知功能
阿尔茨海默病
马尾松松针提取物
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阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）是一种典型的神经退行性疾病，患者出现记忆能力下降和认知模糊[1]，脑中β淀粉样蛋白（Aβ）沉积和神经原纤维缠结是主要病理特征[2].关于AD的发病机制有多种学说，其中“Aβ学说”和“tau学说”是最为被接受的主流学说，而且Aβ沉积和tau功能异常共同参与了AD的发生[3].tau和微管相关蛋白2(MAP2）是脑中两种主要的微管相关蛋白.Aβ在脑内的沉积会诱导tau蛋白过度磷酸化，进而竞争性结合MAP2，导致神经元细胞微管结构稳定下降，大量神经元纤维扭曲缠结一起，致神经元细胞功能丧失而死亡，从而表现出一系列AD临床症状[4].而氧化应激反应、神经炎症反应是引发Aβ沉积的主要原因[5,6,7].超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化酶（GPx）和丙二醛（MDA）又是反应机体氧化应激的重要指标[8]，白细胞介素IL-4及IL-6则是重要的炎症相关因子[9].因此从抗氧化、抗炎病理角度探究治疗AD的药物有一定的临床意义.

早在《本草纲目》中有记载，马尾松（Pinus massoniana Lamb.）松针叶具有祛风活血、明目、安神、降血压等的功效[10].松针多糖具有清除自由基、抗脂质过氧化等作用[11].马尾松松针提取物（Pinus massoniana needle extracts,PNE）能够较容易穿透血脑屏障，减轻大鼠脑缺血再灌注介导的氧化应激损伤[12].为进一步明确PNE对神经的保护作用，本实验采用D-半乳糖联合AlCl3建立AD小鼠模型，研究了PNE对AD小鼠认知功能的影响.

1、材料与方法

1.1 马尾松松针提取物制备[12]

称取新鲜马尾松松针，经榨汁、离心、冷冻干燥，得马尾松PNE干燥粉末（含55.54%多糖），冷藏保存备用.

1.2 试剂及仪器

SOD、CAT、GPx和MDA均购自南京建成生物工程研究所；酶联免疫试剂IL-4和IL-6购自深圳欣博盛生物科技有限公司；兔抗APP、Aβ42、p-tau(Ser 404）、p-tau(Ser 396）、MAP-2(J1121）和兔抗β-actin单克隆抗体购于美国Abcam公司，羊抗兔IgG购自上海碧云天生物技术研究所.其余国产试剂均为分析纯.电泳仪、全自动分光光度计、离心机等主要仪器设备参照文献[13].研究得到陇南师范高等专科学校伦理委员会的批准.

1.3 实验动物分组、造模和给药

昆明小鼠50只，清洁级，兰州大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK（甘）2018-0003.每只体质量18～22 g，随机分对照组、模型组、PNE（低、中、高）剂量组，每组10只.模型组和PNE组动物均腹腔注射D-半乳糖（60 mg/kg）并灌胃AlCl3(5 mg/kg），对照组腹腔注射等量的生理盐水并灌胃等量的双蒸水[13].PNE组自造模起上午给予D-半乳糖和AlCl3外，每日下午灌胃PNE(200、400、800 mg/kg）（以体质量计）[12]，每日1次，每次0.2 mL/10 g，所有实验动物连续处理7周.

1.4 跳台实验

治疗结束后，参考文献[14]，将小鼠放入跳台仪通电，训练5 min，以小鼠受到电击的次数（错误次数）作为记忆获得成绩.24 h后重新试验，以动物自放上平台后至跳下平台的潜伏期及3 min内的错误总数作为记忆巩固成绩.5 d后测试小鼠的记忆再现能力（包括d5).

1.5 组织学观察

参照文献[15]，跳台实验检测结束后将小鼠海马组织用中性福尔马林液（10%）固定，石蜡包埋、切片（6μm）、染色（HE），光学显微镜定位于海马CA1区观察神经元形态结构.

1.6 酶活性测定

跳台实验检测结束后，取各实验组小鼠海马组织，洗净称重、匀浆、离心（3 500 r/min,10 min），用移液器抽取上清液严格按照试剂盒说明测定海马SOD、CAT、GPx的活性及MDA的含量.

1.7 ELISA测定海马组织IL-4、IL-6的含量

跳台实验检测结束后，取各实验组小鼠海马组织，称重、超声匀浆，离心（10 000 r/min,10 min），按照ELISA试剂盒说明测定海马组织中IL-4、IL-6含量.

1.8 Western blotting测定各组海马APP、Aβ42、p-tau、MAP2蛋白的表达

跳台实验检测结束后，取海马组织于无菌EP管中，加入含1%PMSF的RIPA裂解液1 mL，超声波破碎仪粉碎组织30 s（冰上操作），冰上放置30 min,4℃12 000 r/min离心20 min，提取上清液，然后用BCA蛋白质试剂盒测定海马细胞总蛋白量，再经凝胶电泳、转膜和室温封闭，加入兔抗鼠一抗APP(1:1 000）、Aβ42(1:1 000）、p-tau(Ser 396/404)(1:1 000）、MAP2(1:1 000）过夜（4℃），再滴加羊抗兔二抗（1:3 000),ECL显色，以β-actin(1:3 000）作为内参照，用Image Proplus 6.0软件统计.

1.9 数据处理

采用SPSS18.0统计学软件分析数据，实验数据以均数±标准误差（-x±s）表示，组间两两比较采用单因素方差，在数据满足正态分布下，多组均值间的比较采用单因素方差分析，当差异显著时，采用LSD法比较各组均值与同一组均值的差异，P<0.05表示差异有统计学意义.

2、结果

2.1 PNE对小鼠海马CA1区神经元的影响

如图1所示，对照组海马CA1区神经元形态结构基本正常，细胞排列较整齐规则.与对照组相比，模型组小鼠海马CA1区神经元数量减少，细胞排列疏松，细胞核固缩，细胞质浓缩.PNE低、中、高剂量组小鼠海马区CA1区神经元形态有明显改善，数量增多且排列较规则.

图1 PNE对小鼠海马CA1区神经元形态的影响（HE染色标尺示20μm)

2.2 PNE对小鼠认知功能的影响

跳台实验反应小鼠在学习记忆过程中的获得性、巩固性和再现性的障碍情况.如图2所示，与对照组比较，模型组小鼠逃避潜伏期显著缩短、错误次数增加.与模型组比较，PNE低、中、高剂量组小鼠逃避潜伏期明显延长、错误次数减少，提示模型组小鼠认知功能下降，PNE对小鼠认知功能有改善作用.

图2 PNE对AD小鼠跳台实验的影响

2.3 PNE对各组小鼠海马组织SOD、CAT、GPx活性和MDA含量的影响

如图3所示，与对照组比较，模型组小鼠海马组织SOD、CAT、GPx活性极显著下降，MDA含量极显著上升.与模型组比较，PNE低、中、高剂量组SOD、CAT、GPx活性显著上升，MDA含量显著下降.

图3 PNE对AD小鼠海马组织SOD、CAT、GPx活性和MDA含量的影响

2.4 PNE对各组小鼠海马组织IL-4、IL-6含量的影响

如图4所示，模型组小鼠海马组织IL-4含量较对照组极显著下降，IL-6含量较对照组极显著升高；与模型组相比，PNE低、中、高剂量组小鼠海马组织IL-4含量显著升高，而IL-6含量显著下降.

图4 PNE对AD小鼠海马组织IL-4、IL-6含量的影响

2.5 PNE对各组小鼠海马组织APP、Aβ42、p-tau、MAP2蛋白表达的影响

如图5所示，相对于对照组，模型组小鼠海马组织APP、Aβ42、ps396-tau、ps404-tau蛋白表达极显著上升，MAP2蛋白表达极显著降低；相对于模型组，经过不同浓度PNE干预后的小鼠海马组织，MAP2蛋白表达显著升高，其余蛋白表达显著下降.

3、讨论

目前AD发病机制尚未搞清楚，也不能从根本上治愈.所以，国内外学者都热衷于探究治疗AD的药物策略.本实验采用D-半乳糖和AlCl3诱导建立AD小鼠模型，观察和分析PNE对于AD的治疗作用及可能机制.

跳台实验属一次性刺激回避反应实验，利用小鼠受到电击，跳上箱内绝缘平台逃避伤害性刺激的天性，通过不断训练后，小鼠躲避电击而跳上平台，空间认知记忆稳定形成.因此，跳台实验方法常用来评价小鼠的学习与记忆功能.本实验结果显示，随着对小鼠训练天数增加，对照组小鼠对绝缘平台形成了较为稳定的空间记忆，而模型组小鼠的学习记忆能力受损，还未对平台形成稳定记忆，所以，AD小鼠逃避潜伏期显著缩短、错误次数增加，这与之前的文献报道一致[13].病理学结果显示，模型组小鼠海马CA1区神经元细胞出现萎缩，神经元数量明显减少，说明AD小鼠学习与记忆功能损伤.而经过不同浓度PNE治疗干预后，跳台实验显示，小鼠逃避潜伏期显著延长、错误次数减少，学习与记忆能力较模型组明显提升；同时，小鼠海马组织显微技术观察显示，经过PNE不同剂量干预后，小鼠海马神经元排列趋于规则整齐、数量也明显增加，这说明PNE对损伤的AD小鼠脑神经元具有一定的保护作用，进而改善了小鼠在学习与认知功能方面的障碍.

图5 PNE对AD小鼠海马组织APP、Aβ42、p-tau、MAP2蛋白的影响

人体大脑每天要消耗呼吸系统摄入的50%氧气，是一个高耗能器官，也因此在神经元的细胞膜中富含了大量的不饱和脂肪酸，很容易被氧化[12].因此，预防或降低氧化应激反应是治疗AD的有效靶点之一.SOD、CAT、GPx是机体内清除氧自由基、保护细胞膜结构、维持细胞功能的重要抗氧化酶，而脑组织中的这些抗氧化酶含量比较低，更易受到氧自由基的影响[8].本实验结果显示，模型组小鼠海马组织SOD、CAT、GPx活性显著降低，MDA含量显著上升.经PNE干预后，小鼠海马组织SOD、CAT、GPx活性显著升高，MDA含量显著下降，表明PNE能减少脂质过氧化反应，拮抗氧化应激的发生.在AD发生发展过程中，脑实质中Aβ的沉积和高磷酸化tau神经内缠结是各种原因诱发AD的共同途径，是AD发病的关键.在正常生理条件下，Tau蛋白是一种参与神经系统发育的微管相关蛋白，tau与轴突结合以稳定微管并促进微管组装[16].Aβ是由β前体蛋白（APP）通过蛋白酶裂解成长度为39～43个氨基酸的片段，包括Aβ40和Aβ42两个亚型，其中Aβ42更容易聚集[2].在病理条件下，APP异常表达增多或清除减少，引起Aβ不断增加，聚集后形成不溶性的Aβ纤维或老年斑块，使细胞膜中的脂质被氧化而损伤细胞[17,18].同时tau蛋白被过度磷酸化，且多发生在丝氨酸和苏氨酸残基的位点上（主要有181、199、231、396和404等），使tau与微管分离形成纤维聚集[19]，最终导致AD的形成[20,21].MAP2是维持脑细胞骨架系统稳定的另一种重要蛋白，过度磷酸化的tau与MAP2结合，使MAP2水平降低，导致神经元结构、突触蛋白合成和功能的损害[4].

已有研究表明，Aβ42在脑中的大量沉积会激活脑细胞释放炎性细胞因子（如IL-6），引发炎症反应，促进Aβ42转化为具有神经毒性的不溶性沉淀[22,23].IL-4是一种活性较强的抗炎因子，能够抑制脑细胞合成释放炎性细胞因子（IL-1、IL-6和TNF-α等），其水平间接反映脑内的炎症水平[9].本实验结果显示，模型组小鼠海马组织APP、Aβ42、p-tau(ser396和ser404位点）蛋白表达水平及炎症因子IL-6含量显著高于对照组，而抗炎因子IL-4含量及MAP2蛋白表达水平显著低于对照组，说明AD小鼠脑组织发生了炎症反应、Aβ沉积、tau蛋白的磷酸化及MAP2水平下降等病理反应，这与之前的报道一致[4].而经过不同剂量PNE治疗干预后，小鼠海马组织APP、Aβ42、p-tau(ser396和ser404位点）蛋白表达及IL-6含量较模型组显著下降，而MAP2蛋白表达水平和IL-4含量显著升高，说明PNE对小鼠脑组织微管相关蛋白和炎性相关因子表达有明显影响，即能抑制炎症反应、Aβ沉积、tau蛋白磷酸化，提高MAP2水平，从而发挥保护神经元的作用.

综上所述，PNE可改善AD小鼠的认知功能，降低海马组织APP、Aβ42、tau蛋白表达，提高MAP2蛋白表达，减少Aβ的沉积，抑制脑内炎症反应，提高抗氧化酶系活性，发挥神经元保护作用.同时也为预防和治疗AD提供实验依据.

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基金资助:国家自然科学基金项目(32160055);甘肃省第四批省级科技计划(科技重大专项)项目(21ZD4NK045);甘肃省高等学校科研创新基金项目(2020A-276); 甘肃省陇南市社会化出资科技计划项目(2021-SZ-08);

文章来源:王昱,何九军.马尾松松针提取物对阿尔茨海默病小鼠认知功能的作用机制[J].绵阳师范学院学报,2024,43(08):77-84.