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摘要:为研究马尾松松针提取物(PNE)对阿尔茨海默病(AD)小鼠模型认知功能的作用及机制,实验中将50只健康小鼠分成对照组、模型组、PNE低剂量组、PNE中剂量组和PNE高剂量组,用D-半乳糖和AlCl3诱导小鼠建立AD模型,造模同时用PNE(200、400、800 mg/kg)进行灌胃干预.采用跳台实验方法检测小鼠行为学的改变;生物显微技术观察海马组织结构的变化;比色法检测海马组织中SOD、CAT、GPx活性及MDA;ELISA法测定海马组织炎症相关因子白细胞介素IL-4及IL-6含量;Western blotting检测海马组织中APP、Aβ42、tau和MAP2蛋白含量.结果显示,D-半乳糖和AlCl3诱导的AD小鼠模型中,PNE明显延长了AD小鼠的逃避潜伏期,降低了错误次数;改善了小鼠海马CA1区的病理改变;增加了海马组织中SOD、CAT、GPx活性及IL-4含量;降低了海马组织中MDA、IL-6含量;下调了APP、Aβ42和tau蛋白表达;上调了MAP2蛋白表达.结论:PNE对AD模型小鼠的认知功能具有改善作用,其机制可能与提高抗氧化酶系活性,抑制脑内炎症反应,降低APP、Aβ42和tau表达,促进MAP2表达,减少Aβ的沉积有关.
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种典型的神经退行性疾病,患者出现记忆能力下降和认知模糊[1],脑中β淀粉样蛋白(Aβ)沉积和神经原纤维缠结是主要病理特征[2].关于AD的发病机制有多种学说,其中“Aβ学说”和“tau学说”是最为被接受的主流学说,而且Aβ沉积和tau功能异常共同参与了AD的发生[3].tau和微管相关蛋白2(MAP2)是脑中两种主要的微管相关蛋白.Aβ在脑内的沉积会诱导tau蛋白过度磷酸化,进而竞争性结合MAP2,导致神经元细胞微管结构稳定下降,大量神经元纤维扭曲缠结一起,致神经元细胞功能丧失而死亡,从而表现出一系列AD临床症状[4].而氧化应激反应、神经炎症反应是引发Aβ沉积的主要原因[5,6,7].超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GPx)和丙二醛(MDA)又是反应机体氧化应激的重要指标[8],白细胞介素IL-4及IL-6则是重要的炎症相关因子[9].因此从抗氧化、抗炎病理角度探究治疗AD的药物有一定的临床意义.
早在《本草纲目》中有记载,马尾松(Pinus massoniana Lamb.)松针叶具有祛风活血、明目、安神、降血压等的功效[10].松针多糖具有清除自由基、抗脂质过氧化等作用[11].马尾松松针提取物(Pinus massoniana needle extracts,PNE)能够较容易穿透血脑屏障,减轻大鼠脑缺血再灌注介导的氧化应激损伤[12].为进一步明确PNE对神经的保护作用,本实验采用D-半乳糖联合AlCl3建立AD小鼠模型,研究了PNE对AD小鼠认知功能的影响.
1、材料与方法
1.1 马尾松松针提取物制备[12]
称取新鲜马尾松松针,经榨汁、离心、冷冻干燥,得马尾松PNE干燥粉末(含55.54%多糖),冷藏保存备用.
1.2 试剂及仪器
SOD、CAT、GPx和MDA均购自南京建成生物工程研究所;酶联免疫试剂IL-4和IL-6购自深圳欣博盛生物科技有限公司;兔抗APP、Aβ42、p-tau(Ser 404)、p-tau(Ser 396)、MAP-2(J1121)和兔抗β-actin单克隆抗体购于美国Abcam公司,羊抗兔IgG购自上海碧云天生物技术研究所.其余国产试剂均为分析纯.电泳仪、全自动分光光度计、离心机等主要仪器设备参照文献[13].研究得到陇南师范高等专科学校伦理委员会的批准.
1.3 实验动物分组、造模和给药
昆明小鼠50只,清洁级,兰州大学实验动物中心提供,许可证号:SYXK(甘)2018-0003.每只体质量18~22 g,随机分对照组、模型组、PNE(低、中、高)剂量组,每组10只.模型组和PNE组动物均腹腔注射D-半乳糖(60 mg/kg)并灌胃AlCl3(5 mg/kg),对照组腹腔注射等量的生理盐水并灌胃等量的双蒸水[13].PNE组自造模起上午给予D-半乳糖和AlCl3外,每日下午灌胃PNE(200、400、800 mg/kg)(以体质量计)[12],每日1次,每次0.2 mL/10 g,所有实验动物连续处理7周.
1.4 跳台实验
治疗结束后,参考文献[14],将小鼠放入跳台仪通电,训练5 min,以小鼠受到电击的次数(错误次数)作为记忆获得成绩.24 h后重新试验,以动物自放上平台后至跳下平台的潜伏期及3 min内的错误总数作为记忆巩固成绩.5 d后测试小鼠的记忆再现能力(包括d5).
1.5 组织学观察
参照文献[15],跳台实验检测结束后将小鼠海马组织用中性福尔马林液(10%)固定,石蜡包埋、切片(6μm)、染色(HE),光学显微镜定位于海马CA1区观察神经元形态结构.
1.6 酶活性测定
跳台实验检测结束后,取各实验组小鼠海马组织,洗净称重、匀浆、离心(3 500 r/min,10 min),用移液器抽取上清液严格按照试剂盒说明测定海马SOD、CAT、GPx的活性及MDA的含量.
1.7 ELISA测定海马组织IL-4、IL-6的含量
跳台实验检测结束后,取各实验组小鼠海马组织,称重、超声匀浆,离心(10 000 r/min,10 min),按照ELISA试剂盒说明测定海马组织中IL-4、IL-6含量.
1.8 Western blotting测定各组海马APP、Aβ42、p-tau、MAP2蛋白的表达
跳台实验检测结束后,取海马组织于无菌EP管中,加入含1%PMSF的RIPA裂解液1 mL,超声波破碎仪粉碎组织30 s(冰上操作),冰上放置30 min,4℃12 000 r/min离心20 min,提取上清液,然后用BCA蛋白质试剂盒测定海马细胞总蛋白量,再经凝胶电泳、转膜和室温封闭,加入兔抗鼠一抗APP(1:1 000)、Aβ42(1:1 000)、p-tau(Ser 396/404)(1:1 000)、MAP2(1:1 000)过夜(4℃),再滴加羊抗兔二抗(1:3 000),ECL显色,以β-actin(1:3 000)作为内参照,用Image Proplus 6.0软件统计.
1.9 数据处理
采用SPSS18.0统计学软件分析数据,实验数据以均数±标准误差(-x±s)表示,组间两两比较采用单因素方差,在数据满足正态分布下,多组均值间的比较采用单因素方差分析,当差异显著时,采用LSD法比较各组均值与同一组均值的差异,P<0.05表示差异有统计学意义.
2、结果
2.1 PNE对小鼠海马CA1区神经元的影响
如图1所示,对照组海马CA1区神经元形态结构基本正常,细胞排列较整齐规则.与对照组相比,模型组小鼠海马CA1区神经元数量减少,细胞排列疏松,细胞核固缩,细胞质浓缩.PNE低、中、高剂量组小鼠海马区CA1区神经元形态有明显改善,数量增多且排列较规则.
图1 PNE对小鼠海马CA1区神经元形态的影响(HE染色标尺示20μm)
2.2 PNE对小鼠认知功能的影响
跳台实验反应小鼠在学习记忆过程中的获得性、巩固性和再现性的障碍情况.如图2所示,与对照组比较,模型组小鼠逃避潜伏期显著缩短、错误次数增加.与模型组比较,PNE低、中、高剂量组小鼠逃避潜伏期明显延长、错误次数减少,提示模型组小鼠认知功能下降,PNE对小鼠认知功能有改善作用.
图2 PNE对AD小鼠跳台实验的影响
2.3 PNE对各组小鼠海马组织SOD、CAT、GPx活性和MDA含量的影响
如图3所示,与对照组比较,模型组小鼠海马组织SOD、CAT、GPx活性极显著下降,MDA含量极显著上升.与模型组比较,PNE低、中、高剂量组SOD、CAT、GPx活性显著上升,MDA含量显著下降.
图3 PNE对AD小鼠海马组织SOD、CAT、GPx活性和MDA含量的影响
2.4 PNE对各组小鼠海马组织IL-4、IL-6含量的影响
如图4所示,模型组小鼠海马组织IL-4含量较对照组极显著下降,IL-6含量较对照组极显著升高;与模型组相比,PNE低、中、高剂量组小鼠海马组织IL-4含量显著升高,而IL-6含量显著下降.
图4 PNE对AD小鼠海马组织IL-4、IL-6含量的影响
2.5 PNE对各组小鼠海马组织APP、Aβ42、p-tau、MAP2蛋白表达的影响
如图5所示,相对于对照组,模型组小鼠海马组织APP、Aβ42、ps396-tau、ps404-tau蛋白表达极显著上升,MAP2蛋白表达极显著降低;相对于模型组,经过不同浓度PNE干预后的小鼠海马组织,MAP2蛋白表达显著升高,其余蛋白表达显著下降.
3、讨论
目前AD发病机制尚未搞清楚,也不能从根本上治愈.所以,国内外学者都热衷于探究治疗AD的药物策略.本实验采用D-半乳糖和AlCl3诱导建立AD小鼠模型,观察和分析PNE对于AD的治疗作用及可能机制.
跳台实验属一次性刺激回避反应实验,利用小鼠受到电击,跳上箱内绝缘平台逃避伤害性刺激的天性,通过不断训练后,小鼠躲避电击而跳上平台,空间认知记忆稳定形成.因此,跳台实验方法常用来评价小鼠的学习与记忆功能.本实验结果显示,随着对小鼠训练天数增加,对照组小鼠对绝缘平台形成了较为稳定的空间记忆,而模型组小鼠的学习记忆能力受损,还未对平台形成稳定记忆,所以,AD小鼠逃避潜伏期显著缩短、错误次数增加,这与之前的文献报道一致[13].病理学结果显示,模型组小鼠海马CA1区神经元细胞出现萎缩,神经元数量明显减少,说明AD小鼠学习与记忆功能损伤.而经过不同浓度PNE治疗干预后,跳台实验显示,小鼠逃避潜伏期显著延长、错误次数减少,学习与记忆能力较模型组明显提升;同时,小鼠海马组织显微技术观察显示,经过PNE不同剂量干预后,小鼠海马神经元排列趋于规则整齐、数量也明显增加,这说明PNE对损伤的AD小鼠脑神经元具有一定的保护作用,进而改善了小鼠在学习与认知功能方面的障碍.
图5 PNE对AD小鼠海马组织APP、Aβ42、p-tau、MAP2蛋白的影响
人体大脑每天要消耗呼吸系统摄入的50%氧气,是一个高耗能器官,也因此在神经元的细胞膜中富含了大量的不饱和脂肪酸,很容易被氧化[12].因此,预防或降低氧化应激反应是治疗AD的有效靶点之一.SOD、CAT、GPx是机体内清除氧自由基、保护细胞膜结构、维持细胞功能的重要抗氧化酶,而脑组织中的这些抗氧化酶含量比较低,更易受到氧自由基的影响[8].本实验结果显示,模型组小鼠海马组织SOD、CAT、GPx活性显著降低,MDA含量显著上升.经PNE干预后,小鼠海马组织SOD、CAT、GPx活性显著升高,MDA含量显著下降,表明PNE能减少脂质过氧化反应,拮抗氧化应激的发生.在AD发生发展过程中,脑实质中Aβ的沉积和高磷酸化tau神经内缠结是各种原因诱发AD的共同途径,是AD发病的关键.在正常生理条件下,Tau蛋白是一种参与神经系统发育的微管相关蛋白,tau与轴突结合以稳定微管并促进微管组装[16].Aβ是由β前体蛋白(APP)通过蛋白酶裂解成长度为39~43个氨基酸的片段,包括Aβ40和Aβ42两个亚型,其中Aβ42更容易聚集[2].在病理条件下,APP异常表达增多或清除减少,引起Aβ不断增加,聚集后形成不溶性的Aβ纤维或老年斑块,使细胞膜中的脂质被氧化而损伤细胞[17,18].同时tau蛋白被过度磷酸化,且多发生在丝氨酸和苏氨酸残基的位点上(主要有181、199、231、396和404等),使tau与微管分离形成纤维聚集[19],最终导致AD的形成[20,21].MAP2是维持脑细胞骨架系统稳定的另一种重要蛋白,过度磷酸化的tau与MAP2结合,使MAP2水平降低,导致神经元结构、突触蛋白合成和功能的损害[4].
已有研究表明,Aβ42在脑中的大量沉积会激活脑细胞释放炎性细胞因子(如IL-6),引发炎症反应,促进Aβ42转化为具有神经毒性的不溶性沉淀[22,23].IL-4是一种活性较强的抗炎因子,能够抑制脑细胞合成释放炎性细胞因子(IL-1、IL-6和TNF-α等),其水平间接反映脑内的炎症水平[9].本实验结果显示,模型组小鼠海马组织APP、Aβ42、p-tau(ser396和ser404位点)蛋白表达水平及炎症因子IL-6含量显著高于对照组,而抗炎因子IL-4含量及MAP2蛋白表达水平显著低于对照组,说明AD小鼠脑组织发生了炎症反应、Aβ沉积、tau蛋白的磷酸化及MAP2水平下降等病理反应,这与之前的报道一致[4].而经过不同剂量PNE治疗干预后,小鼠海马组织APP、Aβ42、p-tau(ser396和ser404位点)蛋白表达及IL-6含量较模型组显著下降,而MAP2蛋白表达水平和IL-4含量显著升高,说明PNE对小鼠脑组织微管相关蛋白和炎性相关因子表达有明显影响,即能抑制炎症反应、Aβ沉积、tau蛋白磷酸化,提高MAP2水平,从而发挥保护神经元的作用.
综上所述,PNE可改善AD小鼠的认知功能,降低海马组织APP、Aβ42、tau蛋白表达,提高MAP2蛋白表达,减少Aβ的沉积,抑制脑内炎症反应,提高抗氧化酶系活性,发挥神经元保护作用.同时也为预防和治疗AD提供实验依据.
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基金资助:国家自然科学基金项目(32160055);甘肃省第四批省级科技计划(科技重大专项)项目(21ZD4NK045);甘肃省高等学校科研创新基金项目(2020A-276); 甘肃省陇南市社会化出资科技计划项目(2021-SZ-08);
文章来源:王昱,何九军.马尾松松针提取物对阿尔茨海默病小鼠认知功能的作用机制[J].绵阳师范学院学报,2024,43(08):77-84.
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髓鞘的形成需要经过一系列复杂的过程,受到多种因素的调控。成熟的少突胶质细胞由少突胶质细胞前体细胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)分化而来,OPCs在大脑中广泛均匀分布,并且通过自我更新终生维持相对恒定的密度[5~7]。即使是成年后甚至是老年时期,OPCs仍能持续分化成为成熟的少突胶质细胞(oligodendrocytes, OLs)并形成髓鞘。
2024-08-06阿尔茨海默病(AD)是引起痴呆症最常见的病因,在全球范围内影响达5000余万人,预计到2050年患病人数将增加两倍。其主要病理特征包括由β-淀粉样蛋白聚集形成的斑块和由Tau蛋白聚集形成的神经纤维缠结,脑损伤比认知功能明显下降至少提前20年;早发现、早诊断、早治疗是AD的有效防控方法。
2024-08-05阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)为临床常见的神经退行性疾病,该病起病隐匿、病因机制尚未完全明确,AD可严重影响老年人身心健康,目前临床治疗仍以延缓病情进展为主,尚无法根治。有报道称约有1/3的AD患者的发病可归因于可控的危险因素,通过对可控因素进行早期干预可作为AD预防的主要思路。
2024-07-23阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种典型的神经退行性疾病,患者出现记忆能力下降和认知模糊[1],脑中β淀粉样蛋白(Aβ)沉积和神经原纤维缠结是主要病理特征[2].关于AD的发病机制有多种学说,其中“Aβ学说”和“tau学说”是最为被接受的主流学说,而且Aβ沉积和tau功能异常共同参与了AD的发生[3].
2024-07-18阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的慢性神经系统退行性变性疾病,是最常见的痴呆类型。轻度认知障碍(MCI)是处于认知正常与AD的中间阶段,具有向AD发展的高可能性。国际阿尔茨海默病协会(ADI)公布的最新数据显示,2019年全球轻度痴呆人数为2 690万,中度痴呆人数为1 480万,严重痴呆人数为1 340万。
2024-07-15阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是最常见的年龄相关性痴呆,是最具破坏性的且与衰老相关的神经退行性疾病,影响全球约5 000万人[1].该病的主要临床表现为严重的认知功能减退、进行性记忆丧失、逆行性和顺行性健忘,并伴有严重的组织病理学改变,如海马退化甚至丧失[2].
2024-07-08乳酸一直都被人们认做是细胞代谢产生的废物,是导致肌肉酸痛的元凶。随着对乳酸研究的不断深入,乳酸已不再作为代谢废物,Chih等提出星形胶质细胞神经元乳酸穿梭假说,认为乳酸可以作为神经元的能量底物,许多实验(试验)证实了乳酸作为能量底物在大脑能量代谢中的重要作用。
2024-07-03随着疾病的发展,AD的临床症状如记忆衰退、认知功能障碍、精神行为异常及执行力丧失逐渐加剧,严重影响AD患者的生活质量并缩短其寿命。目前人口老龄化形势日益严峻,AD的患病率和死亡率也在逐年增高,预计2050年全球的AD患者数量将有可能超过1.315亿[2]。
2024-06-17阿尔茨海默病(AD)作为临床较常见的一种慢性神经系统疾病,是导致老年人出现认知障碍的原因之一,随着病程延长,患者的认知功能障碍可能持续加重,甚至引起多种行为异常,对其家庭带来严重精神与经济负担。近年来,随着AD发生率的逐渐升高,临床对AD患者的早期治疗与干预的重视程度也逐渐提升。
2024-06-11现有的一线药物均不能有效延缓或阻止AD的进展,在后期临床试验中,以Aβ或tau蛋白为中心的治疗策略未取得有效进展,抗Aβ药物Aducanumab在2021年被批准用于AD的治疗,但该药物的使用目前还存在一些争议,其治疗效果还有待进一步的临床验证[6]。基于现有临床及体外实验证据的系统评价表明,针刺能够有效改善AD患者认知功能及神经炎症[7,8]。
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期刊名称:阿尔茨海默病及相关病
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主管单位:阿尔茨海默病防治协会
主办单位:阿尔茨海默病防治协会
出版地方:北京
专业分类:医学
国际刊号:2096-5516
国内刊号:10-1536/R
创刊时间:2018年
发行周期:季刊
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