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儿童常见急性淋巴细胞白血病前期融合基因的筛查及临床意义

2024-09-23 14 上传者：管理员

摘要：急性淋巴细胞白血病（ALL）是儿童最常见的肿瘤，有近1/4的病例出现耐药和复发，或者伴有不同程度的后遗症[1]。白血病前期融合基因（PFGs）与ALL的发生、发展密切相关。PFGs是由胎儿时期发生产前暴露或随机突变导致造血干细胞/祖细胞发生染色体易位而形成，是ALL发生、发展的第一步。脐带血筛查研究发现一定比例的正常新生儿中存在PFGs。

关键词：
ALL
PFGs
儿童
急性淋巴细胞白血病
白血病前期融合基因
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急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童最常见的肿瘤，有近1/4的病例出现耐药和复发，或者伴有不同程度的后遗症[1]。白血病前期融合基因(PFGs)与ALL的发生、发展密切相关。PFGs是由胎儿时期发生产前暴露或随机突变导致造血干细胞/祖细胞发生染色体易位而形成，是ALL发生、发展的第一步。脐带血筛查研究发现一定比例的正常新生儿中存在PFGs。目前，研究[2]认为PFGs阳性的前白血病克隆细胞在生命早期缺乏微生物暴露或后期感染下可进一步发展成为ALL。PFGs筛查与ALL之间的关系及其临床意义得到广泛研究。本文就PFGs产前起源、筛查研究及其在ALL预防中的临床应用最新进展进行综述。

1、常见PFGs亚型产前起源

PFGs最常见的有4个亚型，分别是MLL-AF4(KMT2A/AFF1)、ETV6-RUNX1(TEL-AML1)、TCF3-PBX1(E2A-PBX1)及BCR-ABL1。Uckun等[3]在流产的胎儿肝脏和骨髓中检测到MLL-AF4融合基因，出现频率分别为38%和25%。在健康新生儿脐带血中，MLL-AF4融合基因的发生率为0.8%[4]。ETV6-RUNX1(TEL-AML1)是最常见的PFGs, 携带者最长可潜伏14年发病[5]。不同人群在健康新生儿脐带血中发现ETV6-RUNX1(TEL-AML1)融合基因的发生率各不相同，其在脐带血样本中的发生率为1%～7%[6-7],2019年TCF3-PBX1(E2A-PBX1)首次在健康新生儿的脐带血中被发现，其发生率约为0.6%[8]。BCR-ABL1的相关研究较少，现有的研究[9]发现在健康脐带血中的发生率为5%～6.25%。

2、PFGs筛查

新生儿PFGs筛查可以帮助识别存在风险的个体，为ALL早期发现、早期治疗提供机会，也可为白血病的发生、发展史提供流行病学证据。PFGs的发生率差异较大，这些差异可能与检测样本及检测方法有关，常见的样本类型有Guthrie卡、脐带血(新鲜或冷冻脐带血),检测方法包括实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、巢式荧光定量PCR(nRT-PCR)及Gipfel法。

2.1 PFGs检测样本选择

不同的检测样本对PFGs发生率的筛查结果具有不同的影响。脐带血是新生儿PFGs筛查研究的常用样本。与冷冻脐带血对比，24 h内采集处理的新鲜脐带血的RNA降解更少，可以更好地代表新生儿造血情况。冷冻脐带血中的凋亡信号可能诱导ETV6-RUNX1(TEL-AML1)融合基因的形成，导致假阳性结果。也有研究[6]认为：无论使用新鲜脐带血还是冷冻脐带血，对PFGs检出率的影响不大。Guthrie卡包含的基因组DNA可保存若干年[10],主要用于PFGs筛查的回顾性研究，不同生物库之间的储存环境以及存档的时间长短可能对其DNA及RNA质量产生影响[11]。相较于脐带血，Guthrie卡因体积小，提供的细胞数量有限[12],因此有可能出现假阴性增多的结果。

2.2 PFGs检测方法

不同的检测方法也可能导致PFGs发生率出现差异。qRT-PCR或nRT-PCR是最常用的两种检测方式。nRT-PCR对PFGs的检测更加敏感，而qRT-PCR可以弥补nRT-PCR无法定量的局限性，但这两种方法在操作过程中易出现扩增产物污染和标本间的交叉污染。因此，既往大多数研究至少会增加使用一种验证方法以进行辅助验证，如荧光原位杂交技术(FISH)、Sanger测序法，但不同研究之间PFGs发生率差异的问题仍然存在。既往研究[4]发现：检测出PFGs阳性的脐带血样品中，PFGs水平非常低(1～3个前白血病克隆细胞/105单个核细胞),该水平非常接近RT-qPCR灵敏度的阈值。此外，如样本在实验中保存或操作不当，极易出现RNA降解，可能会出现假阴性的结果。为此，丹麦研究小组使用了一种基于DNA逆转录PCR技术，这种方法被称为Gipfel法[13],研究小组认为该技术使用的DNA比RNA更稳定，可以获得染色体易位位点的特异性扩增产物，这些产物的大小和序列彼此不同，可以很容易地识别污染物，在一定程度减少误差，特异度高达100%,还可以对扩增产物在大小和精确序列方面进行比较。但该技术也有一定的局限性，需要在出生后24 h内对脐带血样本中的CD19+B淋巴细胞进行流式分选富集[8],难以广泛普及。

随着分子检测技术的发展，PFGs的检测方法也有了更多可能性。下一代测序技术(NGS)目前已广泛用于白血病的诊断与治疗，有研究[14]利用NGS发现正常人也存在克隆造血，但鲜有报道将其运用于PFGs筛查中，考虑高测序深度和高成本限制了大规模实施的可行性。另外，Guthrie卡可能存在RNA质量不高或降解、基因特异性cDNA不足等问题，导致测序失败[12]。

数字PCR(dPCR)可通过Guthrie卡检测PFGs的发生率[15]。相较于qRT-PCR而言，dPCR具有精密度高、重复性好，可以实现绝对定量分析等优势[16]。然而，dPCR需要仔细设计引物和探针，以实现跨多个断点的易位检测，并需要确定阳性液滴阈值来确定真阳性样本，检测成本也高于qRT-PCR。

综上，对于样本的选择，脐带血比较容易获得，单个核细胞数量多，可以提高PFGs筛查的阳性率。目前，国内脐带血大多是自愿捐献或自费保存，不是常规收集，且需大量的资源来处理和储存，难以用于大规模的新生儿PFGs筛查。Guthrie卡易于收集、经济、快捷，是PFGs大规模筛查的理想样本。另外，qRT-PCR与nRT-PCR检测灵敏度高、普及广泛，但qRT-PCR假阳性率更低，且可以定量融合基因表达水平变化。Gipfel法的特异度极高，但对样本要求严格，不适用于筛查。若未来对该方法所用的样本进一步优化，有望得到广泛的应用。新型的检测方法NGS和dPCR用于PFGs筛查的报道较少，仍需更进一步研究。

3、PFGs与ALL发生、发展的关系

产前PFGs的形成是ALL发生的第一步，PFGs阳性的前白血病克隆在感染诱导下发生继发性突变，进展为显性ALL。Greaves[2]提出：感染在ALL发生中具有双重作用，即在生命早期接触微生物具有保护作用，后期感染则会导致严重免疫紊乱而诱发ALL。

流行病学和小鼠模型研究支持感染暴露诱发ALL,小鼠实验证实单独的ETV6-RUNX1(TEL-AML1)、TCF3-PBX1(E2A-PBX1)融合基因不足以引起ALL[17-18]。对TCF3-PBX1(E2A-PBX1)融合基因模型小鼠插入逆转录病毒诱发突变后，发现所有感染逆转录病毒的小鼠都死于白血病[19]。有学者[20]提出“延迟感染假说”,认为感染在生命早期(<1岁)具有保护作用。固有免疫和特异性免疫在围生期或婴儿期需要微生物感染刺激，有助于肠道菌群的代谢物调节T淋巴细胞分化和发育[17];如果婴儿期感染暴露不足，后期感染可诱发严重免疫失调，导致前白血病细胞异常增殖，进而促进ALL的发生。

4、PFGs的临床意义

4.1 PFGs与ALL预防

感染是PFGs进一步发展为ALL的潜在触发因素。因此，生命早期适当的机体感染和后期减少感染对预防ALL有积极意义。维持肠道微生物组的稳定、多样性以及训练免疫可能是未来预防儿童ALL的有效策略。

肠道微生物组是人体最复杂的微生物系统，可以调控肠道局部及全身的免疫系统[18]。肠道微生物组改变可触发PFGs阳性的前白血病克隆转化为ALL[21]。在幼儿期以前建立肠道微生物组对代谢和免疫系统功能具有深远而重要的影响[22]。若在此期间肠道菌群结构发生相对失调，如分娩方式、喂养方式、饮食、抗生素应用等因素均可影响肠道菌群的稳定性和多样性。

自然分娩出生的婴儿会定植与母体阴道和肠道菌群相似的微生物群落。剖宫产分娩切断了婴儿与母亲肠道菌群的接触，更易被来自周围或外界环境的致病菌定植[23]。Marcotte等[24]对9个国家的病例对照分析显示：剖宫产分娩出生的儿童患ALL的风险显著增加。近年有研究[25]给予选择性剖宫产新生儿口服母亲粪便菌群移植，可以帮助其快速建立正常、稳定的肠道菌群。然而，粪口移植也有传播感染性疾病的风险，如新生儿单纯疱疹病毒感染，未来仍需进一步研究。

在生命早期，建立肠道微生物组的最重要方式之一是喂养方式。比较母乳喂养和配方奶喂养的婴儿，肠道微生物组和淋巴细胞群体组成差异显著[26]。研究[27]表明：母乳喂养6个月或更长时间的ALL风险降低了约20%。丰富的膳食纤维饮食也可以间接降低白血病的发展风险，相关机制是肠道菌群发酵，分解膳食纤维，产生短链脂肪酸，促进调节性T细胞扩增，改善效应T细胞的功能，驱动免疫调节和免疫耐受[28]。益生菌、益生元制剂可以恢复微生态多样性，并刺激机体免疫系统，使粒细胞浓度和抗体滴度增加，维持肠道屏障，发挥免疫调节和抗炎作用，进而减少感染的发生[29]。抗生素会减少肠道微生物群的多样性、丰富度以及稳定性[30]。Vicente-Dueňas等[31]发现：遗传易感小鼠在没有感染的情况下，通过应用抗生素导致的微生物组紊乱足以诱导白血病发生，但没有发现导致ALL发展相关的某个特定的微生物，而是微生物群的缺乏与ALL显著相关。因此，在生命早期使用抗生素可能会增加ALL的风险，尤其携带前白血病克隆的婴儿。

生命早期的训练免疫有助于预防ALL。训练免疫是由细菌、病毒、真菌等病原体和疫苗首次进入人体时训练先天免疫系统，从而增强人体对再感染相同和非特异性病原的抵抗力，有助于预防相同或不同病原体的再次感染[32]。卡介苗接种、训练免疫的疫苗、增加日托护理频率及动物接触是有效的训练免疫方法[33]。疫苗对先天性和适应性免疫系统的调节与ALL保护有关。一项meta分析纳入了12项研究，发现早期(3月龄前)接种卡介苗可产生对ALL的保护作用[34]。训练免疫的疫苗是利用训练免疫诱导机制来设计疫苗，增强机体非特异性和特异性免疫反应。MV130是一种舌下疫苗，由全灭活细菌组成(10%革兰阳性菌株与90%革兰阴性菌株),可以有效减少变异性免疫缺陷病呼吸道感染率，降低成人复发性扁桃体炎患者对扁桃体切除术的需求[35]。鉴于儿童ALL发病高峰年龄，设想在这期间应用训练疫苗的交叉保护作用可能具有预防白血病的潜力，需要大规模临床试验和流行病学研究。日托护理是婴儿接触感染暴露的重要途径，英国、法国等研究小组发现在1岁以前经历了日托护理与ALL发生呈负相关[36]。来自美国的一项荟萃研究[37]未发现日托对ALL风险的任何影响。另外，流行病学研究[38]发现：婴儿期与牲畜、家禽、宠物接触不仅可以促进微生物组的多样性，而且可以训练免疫系统，并显著降低B细胞前体ALL的风险。

4.2 PFGs与脐带血移植供体的选择

脐带血被广泛用于各种疾病的治疗。供体细胞白血病(DCL)是异基因造血干细胞移植后的一种严重并发症，预后差，死亡率高。Kondo等[39]发现：脐带血移植后发生DCL的时间明显短于骨髓移植后发生DCL的时间，推测预先存在脐带血的前白血病克隆造成DCL“第一次打击”。因此，在脐带血移植前进行PFGs检查对预防DCL和评估高危人群具有重要意义。

综上所述，PFGs的检测为新生儿筛查白血病提供了可能性，也为儿童ALL的预防和干预提供了临床思路。目前，各地区报道新生儿PFGs筛查发生率结果各异，未来需要更多人群的研究，探索和开发一种使用易收集的新生儿足底血标本且灵敏度更高的检测方法。PFGs转化和进展与感染密切相关，但特定微生物感染尚未明确。找到特定微生物感染，探索其潜在分子机制和途径，有助于研发更有特异性的预防目标和靶点。PFGs筛查有助于降低供体细胞白血病的发生风险，但具体发生机制仍有待进一步研究。

基金资助:广东省基础与应用基础研究基金项目(2019A1515110665);

文章来源:蔡燕珍,邢志浩,文飞球.儿童常见急性淋巴细胞白血病前期融合基因的筛查及临床意义[J].中国妇幼保健,2024,39(19):3900-3903.