子痫前期（preeclampsia,PE）是一种特发性高血压综合征，全球发病率约为4%，若缺乏及时有效的治疗，PE可导致包括肝肾功能受损在内的多器官功能衰竭，是导致妊娠20周后出血、流产、早产、胎儿和孕产妇死亡等不良后果的重要因素[1]。研究发现，PE的发生与胎盘滋养细胞功能紊乱密切相关，胎盘滋养细胞的增殖受阻、凋亡增加、不完全侵袭和子宫内螺旋动脉的异常重塑是PE发生的主要病理机制[2]，且滋养细胞的增殖受阻、凋亡增加已被广泛认为是PE的主要病因[3]。研究表明，一些circRNAs、lncRNAs、miRNAs的异常表达与PE的发生有关[4]。因此，研究与PE发病相关的基因表达变化，及其与滋养细胞增殖、凋亡的关系具有重要意义。

有研究报道，PE患者血液和胎盘组织中均发现异常表达的miRNA，其可能在PE的发生中起着重要的作用[5]。miR-375是近年发现的与细胞增殖和凋亡功能有关的miRNA[6]。miR-375在PE患者血清中高表达，是发生不良妊娠结局的危险因素[7-8]。动物实验发现，miR-375与PE大鼠滋养细胞功能有关[9]。目前miR-375在PE发生发展及滋养细胞功能中的作用尚不完全清楚。因此，本研究通过敲低miR-375，探讨其对PE细胞增殖、凋亡的影响及可能的作用机制，旨在为PE发病机制的探讨提供新的依据。

1、材料与方法

1.1细胞及主要试剂

HTR8/Svneo人绒毛膜滋养细胞购自中科院上海细胞库。RNA提取试剂TRIzol购自北京天根生物公司；RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；反转录试剂盒PrimeScriptTMRTMasterMix、RT-qPCR试剂盒Green®PrimeScriptTMRT-PCR Kit购自日本TaKaRa公司；双荧光素酶报告基因试剂盒购自美国Promega公司；脂质体转染试剂Lipofectamine 3000购自美国Invit‐rogen公司；PCR引物、阴性对照（miR-NC）、miR-375抑制物（miR-375inhibitor）、miR-375模拟物（miR-375mimics）、突变型YAP1荧光素酶报告基因质粒（YAP1-MUT）、野生型YAP1荧光素酶报告基因质粒（YAP1-WT）购自上海吉玛制药公司；EdU增殖检测试剂盒、CCK-8检测试剂盒、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物公司；总蛋白提取试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒购自江苏凯基生物公司；一抗YAP1、caspase-3、Bcl-2、Bax、GAPDH抗体及二抗IgG购自美国CST公司。

1.2细胞培养

HTR8/Svneo人绒毛膜滋养细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，常氧环境：37℃、5%CO2、95%空气；缺氧环境：37℃、1%O2、5%CO2、94%N2。

1.3细胞转染及分组

取对数生长期的HTR8/Svneo细胞接种于6孔板，每孔1×104个，然后随机分为常氧对照组、PE模型组、miR-NC组和miR-375 inhibitor组。miR-NC组和miR-375 inhibitor组细胞应用脂质体转染试剂Lipofectamine 3000按照说明书操作分别转染miR-NC和miR-375 inhibitor，转染24 h后将miR-NC组和miR-375 inhibitor组细胞置于缺氧环境中培养。常氧对照组和PE模型组不进行转染，常氧对照组细胞置于常氧环境培养，PE模型组细胞置于缺氧环境中培养。各组细胞培养48 h后进行后续试验。

1.4 RT-PCR检测miR-375表达

取各组细胞，TRIzol提取总RNA，应用PrimeScript™RT Master Mix反转录生成cDNA。以cDNA为模板，加入PCR引物，应用Green®PrimeScript™RT-PCR Kit按照说明书进行PCR扩增反应。PCR反应条件：95℃10 min;95℃20 s,55℃30 s,70℃30 s，共35个循环。mi R-375正向引物：5´-GGCTCTAGAGGGGACGAAGC-3´，反向引物：5´-GGCAAGCTTTTTCCACACCTCAGCCT TG-3´；U6正向引物：5´-GCTTCGGCAGCACATATACT AAAAT-3´，反向引物5´-CGCTTCACGAATTTGCGTGT CAT-3´。以U6为内参，采用2-△△Ct法计算miR-375的表达。

1.5 EdU荧光染色和CCK-8法检测细胞增殖能力

EdU荧光染色：取各组细胞接种于共聚焦培养皿中，每孔1×105个，随后加入100µL EdU溶液继续孵育2 h，加入细胞固定液固定15 min,PBS清洗后加入EdU反应混合物继续孵育30 min，然后加入DAPI进行核染色，PBS清洗后，应用荧光显微镜采集图像，计算EdU阳性细胞百分比。

CCK-8法：取各组细胞接种于96孔细胞板，每孔1×104个，在常规培养0 h、24 h、48 h时向每孔滴加10µL CCK-8溶液，继续培养2 h后，采用自动酶标仪检测各组细胞在450 nm波长处的光密度（D450 nm）值。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡水平

取各组细胞，PBS清洗2次，用结合缓冲液重悬细胞，分别加入Annexin V-FITC和PI各5µL后，室温避光继续孵育15 min，上流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。

1.7 Western blot检测YAP1、caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表达

提取各组细胞总蛋白，各样本取30µg蛋白行10%SDS-PAGE电泳，然后转移至PVDF膜；加入5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入YAP1、caspase-3、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入二抗，室温孵育1 h,TBST洗膜3次，ECL试剂暗室显影，拍照并分析条带灰度值。

1.8双荧光素酶基因实验检测miR-375与YAP1的靶向调控关系

通过生物信息学软件Targetscan(http://www.tar‐getscan.org/vert＿80/）预测miR-375与YAP1的结合位点。取对数生长期的细胞接种于24孔板，应用脂质体转染试剂Lipofectamine 3000按照说明书操作分别将miR-375 mimics或miR-NC与YAP1-MUT或YAP1-WT共转染至细胞，转染后的细胞分为miR-375 mimics+YAP1-MUT组、miR-NC+YAP1-MUT组、miR-375 mimics+YAP1-WT组、miR-NC+YAP1-WT组，转染24 h后，检测各组细胞的相对荧光素酶活性。

1.9统计学方法

采用SPSS 20.0软件分析数据，计量数据以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组细胞miR-375表达比较

PE模型组细胞miR-375表达高于常氧对照组（P<0.05),miR-375 inhibitor组细胞miR-375表达低于miR-NC组（P<0.05）。PE模型组和miR-NC组细胞miR-375表达比较差异无统计学意义（P>0.05），见图1。

2.2各组细胞增殖水平比较

PE模型组、miR-NC组EdU阳性细胞百分比及0h、24h、48h时的D450 nm值均低于常氧对照组（P<0.05）。miR-375 inhibitor组EdU阳性细胞百分比及0 h、24 h、48 h时D450 nm值均高于miR-NC组（P<0.05）。PE模型组和miR-NC组EdU阳性细胞百分比及各时间点D450 nm值比较差异均无统计学意义（P>0.05），见图2、表1。

图1各组细胞miR-375表达比较

*:P<0.05

2.3各组细胞凋亡率比较

PE模型组细胞凋亡率高于常氧对照组（P<0.05);miR-375 inhibitor组细胞凋亡率低于miR-NC组（P<0.05);PE模型组和miR-NC组细胞凋亡率比较差异无统计学意义（P>0.05），见图3。

2.4各组细胞YAP1、caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表达比较

PE模型组和miR-NC组caspase-3、Bax蛋白表达高于常氧对照组（P<0.05),YAP1、Bcl-2蛋白表达低于常氧对照组（P<0.05）。miR-375 inhibitor组caspase-3、Bax蛋白表达低于miR-NC组（P<0.05),YAP1、Bcl-2蛋白表达高于miR-NC组（P<0.05）。PE模型组和miR-NC组YAP1、caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表达比较差异均无统计学意义（P>0.05），见图4和表2。

图2各组EdU荧光染色阳性细胞

2.5 miR-375对YAP1的靶向调控

Targetscan预测结果显示，miR-375与YAP1具有潜在结合位点（图5a）。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-375 mimics+YAP1-WT组细胞相对荧光素酶活性低于miR-NC+YAP1-WT组（P<0.05),miR-375mimics+YAP1-MUT组和miR-NC+YAP1-MUT组细胞相对荧光素酶活性比较差异无统计学意义（P>0.05），见图5b。

3、讨论

PE是一种复杂的妊娠疾病，其主要特征是水肿、高血压和蛋白尿，近年来PE的发病率居高不下，严重影响孕妇和新生儿的健康。PE的病因和发病机制尚不完全清楚，目前的研究认为PE患者滋养细胞增殖受阻、凋亡增加以及子宫内螺旋动脉的异常重塑导致胎盘缺血、缺氧是PE的主要病理机制[10]。通过缺氧环境培养滋养细胞是目前研究建立PE细胞模型的常用方法[11-12]。建立可靠的PE细胞模型，将有助于阐明PE发生发展的确切机制并找到新的治疗靶点。

表1各组细胞EdU阳性细胞百分比和不同时间D450 nm值比较（±s)

图3各组细胞凋亡率比较

表2各组细胞YAP1、caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达比较（±s)

图4各组细胞YAP1蛋白和凋亡相关蛋白表达比较

miRNA是一种内源性非编码小分子RNA，通过与下游靶基因的3´UTR片段结合抑制靶基因的功能，参与细胞增殖、凋亡等细胞功能的调控。近年来研究发现，PE患者胎盘组织中异常表达的miRNA可能与滋养细胞的增殖、凋亡异常有关[13-14]。岳巾晶等[15]发现，miR-155在PE患者胎盘组织中表达上调，miR-155可能通过影响滋养细胞的增殖、迁移和凋亡参与PE的发病。霍春霞等[16]的研究报道，过表达miR-409-3p能够直接靶向TGIF1促进滋养细胞的增殖。miR-206、miR-486-5p等miRNAs相继被发现与滋养细胞的增殖、凋亡等功能有关[17-18]。miR-375是一种高度保守的miRNA，位于Cryba2和Ccdc108基因之间，定位于人类的2号染色体。目前的研究发现，异常表达的miR-375与免疫细胞、肿瘤细胞的增殖和凋亡等功能异常有关[6]。近期研究发现，miR-375在PE患者血清中高表达[8]；且动物实验结果显示，miR-375异常表达与PE大鼠滋养细胞功能失调有关[9]。为了更深入探讨miR-375在人PE发生发展中的作用及机制，本研究通过缺氧环境培养滋养细胞建立PE细胞模型，结果显示，PE模型组细胞EdU阳性细胞百分比较常氧对照组下降，细胞增殖能力降低，caspase-3及Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，提示PE细胞模型建立成功。本研究进一步研究发现，PE细胞模型中miR-375表达异常升高；通过脂质体转染法敲低PE细胞模型中miR-375表达水平，结果发现与miR-NC组比较，miR-375 inhibitor组细胞EdU阳性细胞百分比升高，细胞增殖能力增强，caspase-3及Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，提示敲低miR-375的PE细胞模型增殖活性明显升高，凋亡水平明显降低。

图5 miR-375靶向调控YAP1基因

目前相关研究显示，miRNA主要通过调控靶基因的转录或翻译，参与机体细胞功能的调节[19]。YAP1是Hippo信号通路的下游信号分子，在细胞生长、凋亡、DNA修复等方面发挥着重要的作用[20]。目前YAP1基因在PE发生发展中的作用研究较多，且YAP1在滋养细胞的增殖、凋亡等细胞功能的调控中也起着重要的作用[21]。研究发现，YAP1在PE患者胎盘和滋养细胞中的表达显著降低，过表达YAP1能够促进滋养细胞的增殖并抑制其凋亡[22-23]。以往研究显示，miR-375能够靶向调控YAP1基因参与细胞功能的调控[24-25]。本研究发现，PE滋养细胞模型中YAP1蛋白表达降低，与以往研究[21-23,26]结果一致；进一步研究发现，与miR-NC组比较，miR-375 inhibitor组细胞YAP1蛋白表达升高，双荧光素酶报告基因结果证实miR-375对YAP1存在靶向调控关系。以上结果提示，敲低miR-375可影响PE滋养细胞的增殖及凋亡，其机制可能与其对YAP1基因的靶向调控有关。

综上所述，敲低miR-375促进PE滋养细胞增殖并抑制其凋亡，其作用机制可能与靶向调控YAP1基因有关，这为PE的发病机制及靶向治疗提供了新的研究方向。

参考文献:

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[11]张玉月,朱亚飞,高丽娜,等.环状RNA BRAF_2在子痫前期胎盘滋养细胞增殖和凋亡中的作用及其机制[J].解放军医学杂志,2023,48(4):374-382.

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[15]岳巾晶,曾莹,郭晓珮,等. mi R-155通过调控PKG1影响滋养细胞生物学功能并参与子痫前期的机制探讨[J].天津医药,2023,51(9):928-934.

[16]霍春霞,谢玲,赵得雄. mi R-409-3p靶向CXCL9调控滋养层细胞的增殖､迁移和侵袭[J].免疫学杂志,2021,37(3):217-223.

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[26]潘怡霞,刘睿,卫婵,等.缺氧环境下YAP1的表达对子痫前期胎盘血管形成的影响及作用机制[J].西安交通大学学报(医学版),2021,42(4):547-553. doi:10. 7652/jdyxb202104010.

基金资助:河北省秦皇岛市科技支撑课题计划项目(202301A138);

文章来源:崔鑫,李秋红,张小学.敲低miR-375对子痫前期模型滋养细胞增殖､凋亡的影响及机制[J].局解手术学杂志,2024,33(11):980-985.