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真核起始因子6调控转化生长因子β1对动脉粥样硬化的影响

2021-05-31 269 上传者：管理员

摘要：目的探讨真核起始因子6(eIF6)调控转化生长因子β1(TGF-β1)对小鼠动脉粥样硬化的影响。方法将RAW264.7细胞分为磷酸盐缓冲液（PBS）组、脂多糖（LPS）组和白细胞介素4(IL-4)组，定量PCR测M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、单核细胞化学趋化蛋白（MCP-1）及M2型巨噬细胞标志物（CD163、Arg-1）及TGF-β1mRNA表达。定量PCR和Westernblotting检测TGF-β1在M1/M2型巨噬细胞中mRNA和蛋白的表达。在ApoE-/-和ApoE-/-/eIF6+/-小鼠动脉粥样硬化模型，定量PCR检测小鼠腹主动脉中TGF-β1、IL-6、MCP-1和Arg-1mRNA的表达。结果与PBS组比较，IL-4诱导后，细胞中CD163和Arg-1表达显著增加；LPS诱导后，细胞中iNOS和MCP-1表达显著增加。TGF-β1在M2型巨噬细胞中表达显著高于M1型巨噬细胞。eIF6慢病毒过表达转染细胞后，TGF-β1mRNA在eIF6过表达细胞中表达水平显著下降（P<0.05）。ApoE-/-/eIF6+/-小鼠主动脉中TGF-β1和Arg-1mRNA表达较ApoE-/-小鼠显著升高；MCP-1和IL-6mRNA表达显著降低。结论eIF6通过调节TGF-β1表达影响巨噬细胞极化，影响动脉粥样硬化发展。

关键词：
动脉粥样硬化
巨噬细胞极化
真核起始因子6
转化生长因子β1
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动脉粥样硬化（AS）是一种慢性炎症疾病[1]，其特征为斑块中泡沫巨噬细胞持续存在，在微环境因子诱导下改变自身表型和功能极化为经典M1型、替代M2型巨噬细胞，其相对比例影响斑块的发展和消退[2]。M1型巨噬细胞分泌促炎性细胞因子，M2型巨噬细胞分泌抗炎性细胞因子[3,4]。TGF-β1表达与动脉出现粥样硬化联系密切，在AS中发挥抗炎症及促纤维化的作用，参与细胞增殖、分化、免疫调节等过程[5]。

真核起始因子6(eIF6）是核糖体功能的关键调节子，参与翻译控制，其表达会改变极化巨噬细胞中的炎症介质，YANG等[6]研究表明eIF6能通过对转录生长因子β1(TGF-β1）启动子的占用来调节TGF-β1的表达。IL-4刺激巨噬细胞后，eIF6野生型及eIF6敲降小鼠中TGF-β1的表达水平显著升高，TGF-β1能够介导抗炎反应抑制炎症的发展[7]。本研究通过细胞动物水平探讨eIF6通过TGF-β1调控巨噬细胞极化对AS的影响。

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级C57BL/6J饲养6～8周健康雄性ApoE敲除小鼠、eIF6基因敲降鼠和C57BL/6J小鼠各18只，体重20～25g。

1.2方法

1.2.1细胞培养及处理

RAW264.7于无菌DMEM(10%胎牛血清，1%青链霉素），置5%CO2、37℃中培养。调整细胞密度约1×106个细胞铺于6孔板。实验分为磷酸盐缓冲液（PBS）组、脂多糖（LPS）组和白细胞介素-4(IL-4）组。LPS终浓度为200ng/mL;IL-4终浓度为20ng/mL，每组6孔，实验独立重复3次。RAW264.7细胞经转染及筛选后获得eIF6过表达和PBS组细胞。

1.2.2动物分组及处理

将8周龄ApoE-/-、ApoE-/-/eIF6+/-和C57BL/6J小鼠分成6组，每组3只，C57BL/6J小鼠为对照组。喂食高脂饲料16周后处死，收集腹主动脉，提取RNA和蛋白。

1.2.3定量PCR

Trizol法提取C57BL/6J、ApoE-/-和ApoE-/-/eIF6+/-小鼠腹主动脉及诱导后的RAW264.7细胞总RNA（小鼠腹主动脉、诱导后细胞及eIF6过表达和对照组细胞总RNA），使用反转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，进行mRNA检测，反应条件为：95℃10s、59℃20s、72℃20s，循环38次。以GAPDH为内参，2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。实验独立重复3次，每个样品以一式三份进行分析。

1.2.4Westernblotting

用1%PMSF裂解液提取小鼠腹主动脉及细胞蛋白，考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳分离并转到PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h,PBST洗膜，分别孵育TGF-β1(1∶1000）、eIF6(1∶500）及β-actin(1∶1000),4℃孵育过夜，PBST洗膜，稀释后二抗常温孵育1h,PBST洗膜，ECL法检测条带。利用ImageJ分析目的条带与内参（β-actin）条带吸光面积积分的比值。

1.3统计学处理

数据采用SPSS26.0分析，计量资料以表示，组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA）。假设检验水准按α=0.05判定，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1M1/M2型巨噬细胞标志物mRNA表达

LPS组诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和单核细胞化学趋化蛋白（MCP-1)mRNA表达水平高于PBS组，IL-4组CD163和Arg-1mRNA表达水平高于PBS组。iN-OS是M1型巨噬细胞标志因子，CD163是M2型巨噬细胞标志因子，巨噬细胞分型成功。见图1。

2.2M1/M2型巨噬细胞中TGF-β1mRNA和蛋白表达

TGF-β1在M2型巨噬细胞中表达显著高于M1型巨噬细胞，其蛋白表达与mRNA表达变化一致。见图2、3。

2.3eIF6过表达和对照组中TGF-β1mRNA表达

与对照组比较，TGF-β1mRNA在eIF6过表达中表达水平显著降低，见图4。

图1M1/M2型巨噬细胞标志物表达

图2极化巨噬细胞中TGF-β1mRNA及其蛋白的表达

图3Westernblotting检测巨噬细胞中TGF-β1蛋白的表达

图4eIF6对照组和过表达组细胞中TGF-β1mRNA表达

2.4小鼠腹主动脉TGF-β1mRNA和蛋白表达变化

AS中，ApoE-/-和ApoE-/-/eIF6+/-小鼠主动脉中TGF-β1mRNA的表达显著增加，较ApoE-/-小鼠，ApoE-/-/eIF6+/-主动脉中TGF-β1表达显著增加。见图5、6。

2.5小鼠腹主动脉炎性因子mRNA表达变化

与ApoE-/-组相比，ApoE-/-/eIF6+/-小鼠主动脉中MCP-1与IL-6mRNA表达显著降低，Arg-1mRNA表达显著升高。ApoE-/-/eIF6+/-小鼠中促炎性细胞因子表达明显低于ApoE-/-小鼠；ApoE-/-/eIF6+/-小鼠中抑炎性细胞因子表达显著高于ApoE-/-小鼠。见图7。

图5各组小鼠腹主动脉TGF-β1mRNA及其蛋白表达

图6Westernblotting检测各组小鼠腹主动脉TGF-β1蛋白的表达

图7各组小鼠腹主动脉炎性因子mRNA表达

3、讨论

AS是一种复杂的慢性心血管疾病，炎症作为其生理病理改变的共同基础贯穿AS发生发展的整个过程[6,8]。巨噬细胞在动脉管壁内皮下炎性反应导致不稳定斑块破裂而引起的动脉局部缺血和坏死过程中起主要作用[7]。巨噬细胞通过吞噬氧化低密度脂蛋白及细胞碎片，分泌细胞因子，产生胶原和基质金属蛋白酶等影响AS的进程和结果[9,10]。巨噬细胞在复杂的斑块微环境中极化为M1/M2亚型，在一定条件下可相互转化，巨噬细胞的功能由其极化状态决定。在AS中，大量巨噬细胞合成和分泌TGF-β1，其在炎症过程中参与组织修复、细胞周期调节，进行免疫调节。M1型巨噬细胞分泌促炎性细胞因子加速发展并导致不稳定斑块破裂。M2型巨噬细胞能够产生抗炎性细胞因子如TGF-β等稳定斑块[11,12]。TGF-β1在AS过程中主要发挥抗炎作用。

eIF6是一种进化保守蛋白，通过调节40S和60S核糖体亚基的结合，在核糖体中起翻译控制作用[13]。eIF6能抑制巨噬细胞中阻断TGF-β1产生的内皮生长因子的产生，减少血管生成。eIF6表达缺陷导致TGF-β1表达增加[14,15]。本实验中，eIF6过表达细胞中TGF-β1表达水平显著降低也证实了这一点，eIF6反向调节TGF-β1。TGF-β1能够促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，诱导α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达，影响动脉斑块的稳定性。

综上所述，eIF6通过反向调节TGF-β1影响AS的发展。

参考文献：

[10]吴宗贵,张华,吴宗贵.巨噬细胞与动脉粥样硬化[J].心血管病学进展,2005,26(3):302-306.

[14]文帅,胡晓红,张小容,等.真核起始因子(eIF6)对M2型巨噬细胞炎性介质表达的影响[J].解放军医学杂志,2015,40(2):104-109.

文章来源：杨帅,黄欣兴,孙雪梅,鲜雪梅,毕颖超,常佳佳,陈仁金.真核起始因子6调控转化生长因子β1对动脉粥样硬化的影响[J].现代医药卫生,2021(10):1629-1631.

基金：江苏省高等学校大学生创新创业训练计划(201810313045Y);徐州市社会发展项目(KC17090)