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PX-12通过氧化应激诱导肝癌细胞凋亡的作用机制

2024-08-27 7 上传者：管理员

摘要：目的：探究PX-12诱导肝癌细胞凋亡的作用机制。方法：选取人肝癌细胞株Huh7作为主要研究对象，采用硫氧还蛋白抑制剂PX-12处理细胞后，CCK8法检测细胞活力，细胞划痕实验检测细胞的迁移能力，细胞增殖试剂盒检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞内活性氧水平和凋亡水平，Western blot检测凋亡相关蛋白表达变化。结果：与对照组相比，PX-12处理组的细胞活力、迁移能力和增殖能力都显著下降（P<0.05），细胞内活性氧水平升高（P<0.05），且呈浓度依赖性。凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和抗氧化剂NAC能恢复其细胞活力，并且NAC能降低PX-12引起的细胞内活性氧的积累，恢复PX-12诱导的细胞凋亡（P<0.05）。结论：PX-12通过氧化应激的方式诱导肝癌细胞发生凋亡。

关键词：
PX-12
氧化应激
消化系统恶性肿瘤
肝癌
肝细胞癌
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肝细胞癌是一种临床常见的消化系统恶性肿瘤，并因其高度侵袭性和隐匿性而成为全球范围内的重要健康挑战[1]。而我国的肝癌患病率和死亡率一直处于各种癌症的前列，其发生受多种因素的影响，其中乙型肝炎病毒感染在我国的广泛传播成为引发肝癌的主要原因之一[2-4]。此外，肝硬化、饮酒过量、长期暴露于亚硝酸盐胺等致癌物质也被认为是中国肝癌发病的重要危险因素[5-6]。值得注意的是，由于肝癌在早期常无明显症状，患者通常在疾病较晚期才被确诊，使得治疗难度大大增加[7]。因此，寻找更有效的治疗手段成为亟待解决的问题。在这一背景下，诸如PX-12这样的新型抗肿瘤药物的研发和应用显得尤为重要。

PX-12是一种有效的thioredoxin-1(Trx-1）抑制剂，作用于Trx-1上Cys73的不可逆硫代烷基化[8]。而Trx-1是一种促进肿瘤生长，抑制细胞凋亡，能上调低氧诱导因子HIF-1α和血管内皮生长因子（VEGF）的低相对分子质量的细胞氧化还原蛋白[9-11]。已有研究表明，Trx-1在急性髓系白血病中表达增高，PX-12能通过抑制Trx-1介导线粒体依赖的细胞凋亡抑制急性髓系白血病[8]。在肝癌病人的血液和癌组织中Trx-1的浓度都较正常人体中显著升高[12]。因此，靶向Trx-1的小分子抑制剂PX-12有望成为治疗肝癌的药物新秀。然而PX-12在肝癌中的作用机制还未有研究，本研究旨在探讨PX-12在肝癌中的作用机制，为肝癌治疗提供新的研究方向。

1、材料与方法

1.1材料

人源肝癌细胞株Huh7,Hep G2和正常人源肝细胞株LO2购自上海科学院细胞库；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；PX-12购自大连美仑生物技术有限公司；Deferoxamine(DFO）购自美国Macklin公司；2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Beyo Click™Ed U-594细胞增殖检测试剂盒，Cell Counting Kit-8(CCK8）和还原型辅酶Ⅱ四钠盐（NADPH）购自上海碧云天生物技术有限公司；巴佛洛霉素A1(Baf A1），乙酰半胱氨酸（NAC),(E/Z)-Necrosulfonamide(Necro）购自美国Med Chemexpress公司；Annexin V-APC/PI Apoptosis Kit（细胞凋亡试剂盒）购自杭州联科生物技术股份有限公司；TRX抗体（ab273877),BCL-2抗体（ab182858）和β-Actin抗体（ab8226）购自英国Abcam公司；caspase3抗体（#9662),PARP抗体（#9542）购自美国Cell Signaling Technology公司；Pro-caspase3抗体（A19654）购自美国ABclonal公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及处理

将3种细胞株放在含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，取对数生长期的细胞用0.25%的胰酶消化传代，进行后续实验。所有细胞均在20代以内。

1.2.2细胞活力检测

将细胞以每孔1×104个的密度接种于96孔板中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜贴壁。用不同浓度的PX-12和所需试剂处理细胞，24 h后取出96孔板，每孔添加10µL CCK8，再放回培养箱反应2 h。待反应完成后用酶标仪在450 nm处检测每孔的吸光度值，并将数据进行归一化处理。用Graphpad Prism 8绘制细胞活力曲线图。

1.2.3细胞划痕实验

将细胞以每孔1×106个的密度接种于6孔板中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养到90%的密度。用10 m L无菌尖端划伤细胞单层一次，形成划痕，并用不同浓度的PX-12处理0 h和24 h。使用显微镜拍摄图像。使用Image J软件评估划痕愈合率，归一化至对照细胞。

1.2.4细胞增殖能力检测

将细胞以每孔6×105个的密度接种于6孔板中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜贴壁。用不同浓度的PX-12处理细胞24 h。按Beyo Click™Ed U-594细胞增殖检测试剂盒说明书的步骤处理细胞，并于激光共聚焦显微镜下观察其荧光强度。Hoechst用于细胞核染色定位；Ed U反应细胞增殖能力。

1.2.5细胞内活性氧（ROS）检测

将细胞以每孔6×105个的密度接种于6孔板中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜贴壁。用不同浓度的PX-12处理4 h后，将细胞收集至1.5 m L的EP管中，用DCFH-DA荧光探针4µmol/L 37℃避光染色30min，在安捷伦流式仪上检测DCFH-DA荧光强度，用Flow Jo处理数据。

1.2.6细胞凋亡检测

将细胞以每孔6×105个的密度接种于6孔板中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜贴壁。用PX-12和NAC处理24 h后，收集细胞，用PBS洗涤。根据制造商细胞凋亡检测试剂盒的说明书，使用流式细胞仪检测细胞凋亡，定量细胞凋亡的百分比。

1.2.7 Western blot法检测蛋白表达

用不同浓度的PX-12处理细胞24 h,PBS洗涤3次后，收集细胞并提取总蛋白。采用BCA试剂盒测定蛋白水平并制成2µg/µL的蛋白样品。取10µL样品进行SDS-PAGE电泳，在蛋白质按照相对分子质量大小进行分离后将蛋白转移至PVDF膜上，转膜后用5%脱脂牛奶封闭1 h。将免疫印迹膜置于一抗中，4℃摇床孵育过夜。TBST缓冲液洗涤3遍，在相应辣根过氧化物酶标记的二抗中孵育1 h。最后在ECL显影液中反应20 s，用Bio-Rad凝胶成像仪进行曝光分析。

1.2.8统计学处理

采用Graphpad Prism 8软件进行统计学分析。计量数据用均数±标准差（xˉ±s）表示，采用单因素方差分析；P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 PX-12对细胞活力的影响

我们用不同浓度的PX-12处理细胞24 h，细胞活力逐渐降低，呈浓度依赖性（Fig.1,P<0.05）。由于Trx-1在肝癌细胞中表达升高，PX-12对肝癌细胞系Huh7和Hep G2的抑制效果较正常肝细胞LO2要显著，其中PX-12对Huh7细胞活力影响最为明显，Hep G2次之，对LO2细胞活力影响较小，故采用Huh7细胞进行后续实验。

2.2 PX-12对细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验是一种常用的评估细胞迁移能力的研究方法。分别用0、20、40µmol/L的PX-12处理Huh7细胞24 h后，Huh7细胞的迁移能力被PX-12所抑制，且浓度越高抑制越明显（Fig.2,P<0.01）。

2.3 PX-12对细胞增殖能力的影响

Beyo Click™Ed U-594细胞增殖检测试剂盒是一种简单、快速、高灵敏的试剂盒，利用将胸腺嘧啶脱氧核苷类似物Ed U标记为Alexa Fluor 594实现对细胞增殖的快速检测。分别用0、20、40µmol/L的PX-12处理Huh7细胞24 h后，与0µmol/L组相比，加入PX-1220µmol/L和40µmol/L后红色荧光的Alexa Fluor594强度明显下降，表明细胞增殖能力受到显著抑制，并且40µmol/L PX-12的抑制效果更加明显（Fig.3,P<0.01）。

2.4 PX-12诱导细胞发生氧化应激

为探究PX-12抑制Huh7细胞活力、迁移能力和增殖能力的原因，我们采用不同细胞死亡机制的抑制剂联合PX-12处理细胞。结果表明，抗氧化剂（NAC）和凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK）能显著恢复PX-12对细胞的活力抑制，而铁死亡抑制剂（DFO），坏死抑制剂（Nerco）和自噬抑制剂（Baf A1）则没有这种效果（Fig.4A,P<0.01）。已有研究证实，PX-12可以在多种细胞中诱导凋亡，但NAC的显著作用引起了我们的兴趣，为排除PX-12的脱靶效应，我们检测了另一种Trx-1抑制剂金诺芬（Auranofin）与各细胞死亡抑制剂的联合效果。结果显示NAC和Z-VAD-FMK也能恢复Auranofin对细胞的活力抑制（Fig.4B,P<0.01）。因此，我们推测PX-12和Auranofin抑制细胞Trx-1后，可能会引起细胞内发生氧化应激。随后我们用PX-12和Auranofin联合NAC处理细胞，检测细胞内ROS水平的变化。结果表明，添加PX-12和Auranofin后，细胞内ROS水平显著升高，联合NAC后，ROS水平有所恢复（Fig.4C-D,P<0.01）。

2.5抑制氧化应激能缓解PX-12诱导的细胞凋亡

我们采用凋亡试剂盒检测不同浓度的PX-12对Huh7细胞凋亡的影响，结果表明，PX-12能使晚期凋亡细胞显著增加，且呈浓度依赖性（Fig.5A,P<0.01）。随后采用NAC联合PX-12观察抑制氧化应激对其凋亡作用的影响，结果显示加入NAC能显著减少PX-12引起的晚期凋亡细胞数量（Fig.5B,P<0.01）。Western blot结果显示，PX-12能使Huh7细胞内Trx-1蛋白的表达减少(Fig.5C,P<0.05);NAC恢复了PX-12引起的凋亡相关蛋白含量变化（Fig.5D,P<0.01）。

3、讨论

肝癌是一种临床常见的实体恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居世界前十位，5年生存率仅为18%[1,13]。目前手术切除是肝癌最有效的治疗方案，但由于大部分患者被确诊时都已处于晚期，所以化疗是其最主要的治疗方案[7]。临床上目前唯一批准用于治疗晚期肝癌的一线靶向药物是索拉菲尼，但是其较早出现的耐药性使得治疗难以持续[14-15]，因此探索新的能够有效治疗肝癌的药物尤为重要。

PX-12是抗氧化蛋白Trx-1的抑制剂，能与Trx-1的活性位点结合，阻碍其与底物的结合，从而抑制其催化活性，常被用做抗肿瘤研究[16]。PX-12已被证明对几种类型的癌细胞具有抗肿瘤活性，但其治疗肝癌的研究鲜有报道[17-19]。Trx-1中在多种癌症中表达上调，具有促进肿瘤生长、抑制细胞凋亡的作用，其中就包括肝癌[12]。此外，PX-12和索拉菲尼能够协同抑制肝癌细胞，但并未阐明PX-12在肝癌中发挥的具体作用机制[20]。

在本研究中，我们用PX-12处理肝癌细胞Huh7和Hep G2，以及正常肝细胞LO2，结果显示PX-12能显著抑制肝癌细胞的细胞活力，而对LO2细胞活力抑制不明显，这可能是Trx-1在肝癌中表达升高引起的。不仅如此，PX-12处理肝癌细胞后其侵袭能力和增殖能力都表现出了显著下降，表明利用PX-12抑制肝癌具有潜在的利用价值。

此外，PX-12能够引起肝癌细胞ROS显著增高，且呈浓度依赖性。联合抗氧化剂NAC后，PX-12的效果明显削弱，表明PX-12可能是通过引起细胞氧化应激的方式抑制肝癌细胞。先前的研究表明，肝癌细胞内大量的ROS积累将导致线粒体跨膜电位的失衡，从而导致线粒体自噬和内源性细胞凋亡[21]。我们的结果表明，凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和抗氧化剂NAC均能恢复PX-12对肝癌细胞的活力抑制；为排除PX-12的脱靶效应，我们使用Auranofin抑制Trx-1，并联合各种细胞死亡抑制剂检测它们对细胞活力的影响，结果表明Z-VAD-FMK和NAC也能恢复Auranofin对细胞的抑制作用。随后，NAC分别联合PX-12和Auranofin检测细胞内ROS水平的实验结果显示，添加NAC后，PX-12和Auranofin导致的细胞内ROS升高均恢复，进一步证实了细胞氧化应激在PX-12抑制肝癌细胞中的重要作用。此外，我们用流式细胞术检测了细胞内凋亡细胞的水平，结果显示添加PX-12后，凋亡细胞数显著增加，且呈浓度依赖性；联合了NAC后，细胞内凋亡水平下降。Western blot结果显示，PX-12能引起Huh7细胞发生凋亡，联合NAC后，这种凋亡表现得到抑制。因此，我们推测PX-12是通过氧化应激的方式诱导肝癌细胞发生凋亡，从而抑制肝癌细胞。

综上所述，本研究证明PX-12通过抑制Trx-1引起肝癌细胞氧化应激，进一步触发细胞凋亡，从而表现出抑制肝癌细胞的能力。这一机制的发现可能为临床治疗肝癌提供新的思路，也为PX-12的抗癌作用机制提供更多的理论依据。

参考文献:

[3]李鸿侠,孙一萌,张鸿涛,等. HBV DNA聚合酶在介导HBV相关肝细胞癌肿瘤细胞免疫逃逸中的作用[J].临床肝胆病杂志, 2023, 39(12):2858.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(82102938);

文章来源:雷国杰,于艳华,刘影超,等.PX-12通过氧化应激诱导肝癌细胞凋亡的作用机制[J].中国临床药理学与治疗学,2024,29(09):961-967.