植物生理学是研究植物生命活动规律及其与环境之间相互关系的科学[1]。华南农业大学植物生理学课程是农学及生物类专业的核心课程，其实验教学具有很强的实践性和应用性。实验教学在培养学生操作技能、研究及应用能力方面发挥着重要作用，且在促进学生深入认识、巩固并拓展植物生理学理论知识方面同样发挥着关键作用[2-3]。2022年，华南农业大学入选“双一流”建设高校，农业科学等学科进入ESI排名全球前1%。然而当前我校植物生理学实验教学内容与科学研究联系不紧密，更新速度滞后于日新月异的科研成果，不能充分满足拔尖创新和行业领军人才培养需要。2019年，“新农科”建设提出，以“融合发展”“多元发展”“协同发展”推动农林高校的内部改革，通过科教融合、产学研结合的人才培养模式，打破固有专业壁垒，推进“两性一度”金课建设[4]。鉴于以上背景，本团队期望以科教融合的方式打破专业屏蔽，推进植物生理实验教学改革。

PBL(problem-based learning)教学法，即以问题为导向的教学方法，以学生为中心的教育方式，强调以学生的主动学习为主，将学习与更大的任务或问题挂钩，通过学习者的自主探究和合作来解决问题，从而学习隐含在问题背后的科学知识，培养解决问题的技能和自主学习的能力[5]。PBL教学法目前已成为国内外流行的一种教学方法。本教学改革基于此方法，以农业生产中的实际问题，即番茄果实着色不均为教学实验切入点，通过查阅文献引导学生思考，提出“温度、光照或两者综合可能是影响果实色泽着色不均的环境因子”的假设。基于此假设，学生在教师引导下设计不同温度+光照强度组合的多因子实验进行研究，最终将实验结果应用于番茄的大田生产实践。该实践教学运用PBL方法结合农业生产，通过“观察果实着色不均现象-分析问题-提出假设-设计实验-研究问题-得出结论-指导生产”的完整产-学-研结合流程，较好培养了学生的科研思维、创新研究及综合应用能力；除此之外，还使学生切实感受理论与实践、农业生产与科学研究的紧密联系，增强学生从事农业现代化建设工作的使命感，潜移默化培养学生的“三农”情怀。

1、实验背景

色泽是果实品质的重要组成部分，即便是风味极佳的果实，也只有充分表现出其特征色泽时，在市场上才具有吸引力和竞争力。课题组在长期研究番茄果实后熟过程中发现，与华南地区9—12月种植(秋种)的番茄果实相比[图1(c)和(d)],3—6月种植(春种)的番茄果实易出现着色不均的现象[图1(a)和(b)]。春种番茄果实着色不均，品质下降，导致广东春种番茄栽培面积逐年减少[6],这与我省作为南菜北运和供港澳蔬菜生产中心的战略地位极不匹配[7]。众所周知，叶绿素降解及番茄红素大量合成使番茄果实由绿色转变为黄色或者红色，赋予果实诱人的色泽及丰富的营养[8]。在番茄果实成熟的过程中，究竟是叶绿素降解还是番茄红素合成出现问题，导致春种番茄果实出现着色不均的现象?又是什么因素影响了色素的变化?其背后的分子机理如何?根据以上番茄栽培中出现的科学问题，运用PBL法，指导学生通过模拟春种番茄栽培中的环境因子，明确影响果实着色不均的内在和外在因素，进而利用分子生物学手段解析果实着色不均的分子机理，为解决春种番茄着色不均提供技术和理论支持。

图1春/秋种番茄果实照片

2、教学设计思路

本课程运用PBL方法，以农业生产中出现的现象，引导学生通过“提出科学研究问题-开展实验设计-验证科学假设-实验结论指导生产实践”等环节系统地开展进行教学实践改革。实验共分为两大模块：第一模块注重以PBL方式培养和训练学生的科学思维，引导学生分析春种番茄果实着色不均的原因，提出科学假设，并确定研究方案，开展实验；第二模块注重培养学生理论联系实际的能力，将实验结果运用于生产实践为番茄栽培提供技术支持，实现“产-学-研”的有机结合。

2.1 生产问题引导实验研究

第一次课(4学时),基于PBL方法，教师逐层递进提出科学问题，引导学生查阅文献回答问题和提出科学假设。以华南地区春种番茄果实着色不均的现象为切入点，通过展示着色不均果实的照片，引导学生回答第一个层面问题：“什么原因导致春种番茄果实着色不均?”通过查阅文献，学生可知番茄果实的色泽是由叶绿素降解和番茄红素积累共同决定。教师接下来引导学生回答第二个层面问题：“什么原因影响果实中叶绿素降解和番茄红素积累?”春种和秋种番茄的基因型相同、栽培技术相似，但栽培环境不同，因而学生通过排除法可知环境是影响色泽的主因。通过文献资料对比分析，发现华南地区3—6月和9—12月温度和光照变化显著。基于此，教师引导学生提出“温度、光照或两者综合可能是影响果实色泽着色不均的环境因子”的科学假设。在帮助学生理清实验思路后，教师指导学生开展不同温度和光照排列组合对果实色泽影响的实验设计。课后学生根据实验设计方案在不同时间点拍照并取样。

第二次课(4学时)注重学生实验技能训练。观察并记录不同光照+温度组合处理下番茄果实的表型，开展叶绿素和番茄红素含量测定，明确番茄红素积累减少是果实出现着色不均的原因，环境温度控制番茄红素的合成。学生学习检测果实硬度和色素含量，判断果实的成熟度，结合植物生理学中光合作用章节知识，引导学生进行色素分离和理化性质分析等实验。

2.2 实验结果指导生产实践

植物生理学是一门典型的实验科学，其知识来源和发展高度依赖生产实践，因此植物生理学教学强调实践出真知和理论联系实际。

第一次课(4学时)侧重强化学生的实验分析能力。基于上述实验结果，已知高温抑制了果实番茄红素的合成，教师提出“田间生产中影响番茄果实色泽转变的临界温度是多少”的问题，引导学生设计不同梯度的温度处理绿熟期的番茄果实，为今后春种番茄采用大棚控温提供技术咨询。通过文献研究，多数学生会将绿熟期的番茄果实置于25、30、35和40 ℃等4个温度处理组。课后学生根据实验设计方案在不同的时间点拍照观察果实色泽变化及取样，并提取RNA,开展反转录实验。

第二次课(4学时),基于实验结果，教师引导学生将实验结果应用于生产实践。学生通过观察番茄的色泽明确影响果实着色不均的临界温度。为了进一步阐明果实着色不均的分子机理，从当前问题切入，引导学生继续查阅文献，发现Stay Green基因(SGR1)主导的 PAO/phyllobilin 途经被公认为叶绿素降解的主要途径，Phytoene synthase基因(PSY1)则是番茄红素合成通路中的关键限速酶。学生可应用荧光定量PCR法检测SGR1和PSY1基因的表达规律，学会通过与内参基因EF-1α的荧光变化计算出目标基因的相对表达量。选定25和35 ℃温度处理下的样品cDNA为模板，比较温度和光照对叶绿素降解和番茄红素合成关键基因的影响。待学生完成目标基因的相对表达量计算后，教师引导学生综合分析研究结果并撰写实验报告。通过批改实验报告发现，同学们能很好地根据实验结果解释春播番茄果实着色不均的原因：春种番茄果实成熟时正值5—6月，光照充沛，田间果实受阳光照射不均，易导致果实出现局部温度较高现象，而高温抑制番茄红素合成关键基因SlPSY1的表达，进而延缓果实局部番茄红素的积累，导致果实出现着色不均的现象。根据此实验结果，部分同学对春播番茄提出了技术建议：在5—6月收获番茄果实时要加强大棚内部的通风，可在大棚顶部增加一层黑色遮光布，降低大棚内的温度，防止大棚内温度超过30 ℃。由此说明学生创新研究思维和综合实践能力均有较明显提升。

3、教学实验设计

3.1 实验目的

(1)以科学研究问题为起点，掌握科学研究的设计思路，学会实验设计及研究分析。(2)掌握光合色素的提取、分离和含量测定方法；了解叶绿素/番茄红素含量比值与果实色泽表型的关系。(3)掌握果实硬度测定的方法，了解果实硬度与果实成熟度之间的关联。(4)了解提取RNA和反转录方法，掌握qRT-PCR的技术及其工作原理，学会基因表达结果分析及方差分析。

3.2 实验涉及理论知识点

植物叶绿体色素包括叶绿素a、叶绿素 b、β-胡萝卜素和叶黄素，是进行光合作用的重要物质。因其不溶于水，而溶于有机溶剂，可用乙醇或丙酮等进行提取，并采用分光光度计精确测定[9]。

番茄果实的成熟涉及硬度变化、叶绿素降解、番茄红素合成、糖代谢等一系列生理生化反应。番茄果实色泽由绿转红是由色素种类和含量变化所致，主要由叶绿素含量下降和番茄红素含量升高所致[8,10]。

荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[11-12]。

3.3 实验材料与方法

3.3.1 番茄材料

一个实验班约30人，将学生以5人为一组。实验采用的番茄材料为教师在温室栽培的野生型番茄品种 AC(Solanum lycopersicum, cv. Ailsa Craig)。

3.3.2 番茄果实取样及处理

绿熟期的番茄果实分为两组，分别放置在25 ℃+光照(光照强度为25 000～30 000 lx)、40 ℃+光照的培养箱中。在本实验中，光照和黑暗处理在同一个果实中同步进行。具体做法如下：同一个果实的一半用锡纸包覆作为黑暗处理，另外一半裸露的果实接受培养箱中的光照作为光照处理。即本实验中有25 ℃+光照(HL)、25 ℃+黑暗(D)、40 ℃+光照(HL)及40 ℃+黑暗(D)等4个处理。HL为半果体系中光照处理的半边果实，D为同一个果实遮光处理的另外半边果实。以放入恒温箱前为第0天，分别在第1、2、3和4天取样拍照。

3.3.3 色素提取和含量测定

叶绿素：液氮研磨番茄果实样品0.4～0.6 g, 将粉末加入10 mL离心管中，加2 mL体积比为1∶8∶1的0.2 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)∶丙酮∶ddH2O提取缓冲液，涡旋振荡2 min。将浸提液冰上放置30 min后，8 000 r/min, 4 ℃离心10 min, 取上清液转移到新的离心管，重复浸提至粉末绿色消失。将浸提液混合均匀并定容至6 mL。使用酶标仪(TECAN,INFINITE MPLEX,日本)测定叶绿素浸提液在663和645 nm处的吸光值[13]。计算公式：

叶绿素浓度=20.2×OD645+8.02×OD663

番茄红素：液氮研磨0.4～0.6 g样品加入10 mL离心管中，添加5 mL丙酮：正己烷(4∶6),涡旋振荡2 min后，4 ℃静置浸提直至粉末变为无色。将浸提液8 000 r/min、4 ℃离心10 min后，取上清液转移到新的离心管。使用酶标仪(TECAN,INFINITE M PLEX,日本)测定浸提液在663、645、505和453 nm处的吸光值[14]。计算公式为

番茄红素=-0.045 8×OD663+0.204×OD645+0.372×OD505-0.080 6×OD453

3.3.4 番茄果实硬度测定

使用果实硬度计(GYJ-4,乐清市艾德堡有限公司，中国)测定番茄果实硬度，测定每个果实中部赤道位置的硬度值(N)。

3.3.5 RNA的提取和反转录

使用植物RNA提取试剂盒HiPure HP Plant RNA Mini Kit(美基，R4165,广州)提取番茄果实总RNA。细胞裂解液为PlantZol Reagent(美基，R4804,广州)。使用NanoDrop 2000检测样品总RNA的浓度。用1%琼脂糖凝胶电泳检测样品总RNA的质量，设置电压为90～100 V,时间20～30 min。

以总RNA为模板，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa, RR047A,日本)进行cDNA第一链的合成。所得产物为cDNA,保存于-20℃备用。

3.3.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞，Q711-02,南京)进行荧光定量PCR反应。反应体系详见表1,qPCR引物序列信息请见表2。荧光定量PCR通过与内参基因EF-1α的荧光变化进行对比反映出目标基因的表达量。

表1荧光定量PCR反应体系

表2 qRT-PCR引物序列信息表

4、实验结果与分析

4.1 不同光照+温度组合明确影响番茄红素合成的环境因素

绿熟期的番茄果实设置了25 ℃+光照、25 ℃+黑暗、40 ℃+光照及40 ℃+黑暗等4个处理。25 ℃下番茄果实在第3天时光照处理的果皮变为红色，黑暗处理的果皮为黄绿色；直至第4天，黑暗处理的果皮才变为红色。黑暗处理组果实合成番茄红素的速度要慢于光照处理组，但仍能正常合成番茄红素。尽管果实在黑暗和光照下合成番茄红素的速度上有差异，但最终果实均可以正常变红，结果表明光照不是影响果实色泽转变的关键因子。40 ℃下番茄果实在第3天时光照处理组果皮为黄绿色，黑暗处理组果皮为绿色；在第4天时，光照处理的果皮变为黄色，黑暗处理的果皮为浅绿色(图2)。在40 ℃的处理下，无论是光照还是黑暗处理的果实都无法合成番茄红素，实验结果表明高温抑制了果实的番茄红素合成。

25和40 ℃中的后熟番茄果实硬度均由0天的35 N,分别下降至15 N和5 N,表明果实均能正常后熟[图3(c)]。25和40 ℃处理组的果实分别在第3天和第4天时，半果体系中黑暗和光照组的果皮色泽差异最为明显，因而分别选择这两个时间点的果实测量叶绿素和番茄红素含量的变化。结果发现25 ℃下，光照和黑暗处理组中的果皮叶绿素均能降解，番茄红素均上升，黑暗处理组中的番茄红素积累慢于光照处理；40 ℃下，番茄红素的积累在光照与黑暗处理组中都受到了抑制，光照和黑暗处理组中的番茄叶绿素均能正常降解，黑暗处理组中的叶绿素降解慢于光照处理[图3(a)和(b)]。综合以上结果发现：高温影响了番茄红素的合成，导致果实着色不均，而在适宜温度条件下光照有助于叶绿素的降解和番茄红素的积累。

图2不同光照强度+温度组合下果实的色泽变化

4.2 确定抑制果实番茄红素合成的临界温度

基于“高温抑制果实番茄红素的合成”的实验结果，教师在课堂上运用PBL法提出“生产中维持番茄果实色泽正常转变的临界温度是多少度”的问题，激发学生理论运用实际的兴趣。学生通过查阅文献，设置了25、30、35和40 ℃等4个温度梯度。随后，将绿熟期番茄分别置于4个温度中进行后熟。在后熟的第9天，25和 30 ℃处理组的番茄果实叶绿素开始降解，番茄红素则从第12天开始大量积累。35 ℃处理组的番茄果实在第9天也具有明显的褪绿现象，但一直到后熟的18 d, 其果实都无法合成番茄红素，不能转红。40 ℃处理组的番茄果实在第9天褪绿，也始终无法合成番茄红素(图 4)。结果表明：30 ℃及以上的温度抑制番茄果实番茄红素的合成。实验结果启示在番茄栽培中，果实后熟期间田间温度应维持在30 ℃及以下。

图3不同光照强度+温度组合对果实色泽和硬度的影响

图4不同温度处理对番茄果实色泽的影响

4.3 不同温度对叶绿素降解和番茄红素合成关键基因的影响

选定表型最为明显的25和35 ℃处理组的番茄为材料，分析叶绿素降解和番茄红素合成关键基因对温度的响应。结果发现在果实色泽转变过程中，25和35 ℃处理组的SlSGR1表达量均呈上升-下降的趋势。25和35 ℃处理组中的SISGR1表达量分别在第12天和第6天出现峰值，其表达量为分别0天的12和10倍[图5(a)]。25 ℃处理组中的SlPSY1表达量亦呈上升-下降的趋势。SIPSY1表达量在第12天达到峰值，其表达量为0天的5倍。35 ℃处理组中的SlPSY1表达量呈下降趋势，与0天相比始终维持在一个极低的表达水平。SlPSY1在25 ℃处理组的表达量始终大于35 ℃处理组[图5(b)]。高温通过抑制SlPSY1的表达，降低了果实中番茄红素的合成(图5)。

4.4 实验总结

综合以上实验结果，发现温度是控制果实番茄红素合成的关键因子，高温通过抑制番茄红素合成基因SlPSY1的表达，进而抑制番茄红素的合成。在适宜的温度下(25 ℃),光照有利于果实中番茄红素的积累。在课堂讨论时，教师基于PBL教学法引导学生归纳梳理整个综合实验的思路： 从生产中的实际问题出发，运用比较法和排除法提出假设，设计实验和开展实验研究；实验完成后，再运用启发式教学，引导学生进一步结合实验结果分析温度和光照如何影响果实色泽的转变，并对前期假设进行总结及反思。通过整个课程的学习，学生科学研究的思维得到了系统训练。教师进一步指导学生运用实验结果指导生产，依据实验结果对春播番茄提出技术建议：春播番茄在5—6月收获果实，彼时要加强大棚内部的通风，可在大棚顶部多加一层黑色遮光布，降低大棚内的温度，防止大棚内温度超过30 ℃。

图5不同温度处理对番茄叶绿素降解和番茄红素合成基因的影响

5、教学方法的反思

农业生产、科学研究及实验教学之间是紧密结合并相互促进的。生产中的问题，往往成为科学研究的热点，科学研究成果反过来进一步指导生产实践[17]。同时，科研的思路和技术方法，又常常被带入教学中激发学生学习理论知识的兴趣，培养学生的科学研究及知识应用能力[18-19]。该植物生理学综合性实验以农业生产需求为导向，融合植物生理学与分子生物学实验内容，在教学过程中运用PBL法，引导学生提出科学假设和设计实验方案，较为系统地训练了学生科研思维和综合能力。此外，本课程通过“农业生产问题-分析问题-提出假设-实验设计-研究分析-得出结论-指导生产”螺旋上升的教学方式，使学生切实感受到理论与实践、农业生产与科学研究的紧密联系，增强学生从事农业现代化建设学习和工作的使命感，潜移默化地培养学生的“三农”情怀。

本实验过程包含自主设计、文献研究、课堂讨论、实验探索、生产应用等多个环节，帮助学生建立科学探索思维，培养学生学以致用的综合能力，具有良好的实践意义和应用价值，但在教学实践中，要使该实验达到最佳教学效果，需结合实验周期、学生兴趣及实际能力等问题综合考虑：(1)如何运用PBL教学法引导学生针对生产中的问题提出科学假设。本实验先展示生产实践中的现象，引导学生运用比较法及排除法分析文献，推测出温度和光照可能是影响果实着色不均的环境因子，进而提出科学研究问题。并通过实验设计逐步验证猜想，系统训练学生的科学思维。(2)学生是否具有自主提取RNA的能力。提取RNA对学生操作要求高，因此不做硬性要求。教师可根据学生实际情况，鼓励学有余力的学生自主提取RNA,同时也会提供RNA,保证实验的整体性和连续性。(3)实验涉及影响色素的环境因素不是单一因子，如何在有限的课堂教学中完成本次综合性实验，实验的巧妙设计非常关键。本次实验应用半果实验体系：在一个温度体系下用锡箔纸覆盖一半的番茄果实进行黑暗处理，而另外一半的果实则进行光照处理。半果实验体系不但大大减少了样品的数量及实验工作量，并能在一个番茄果实上让学生看到不同光照强度对色素积累的影响。该设计现象明显、有趣，能激发学生的兴趣，从而达到培养学生逻辑思维及动手能力的目的，大大提升了实验教学成效。

实验课后学生认真撰写实验报告，并依据实验结果为广东地区春播番茄积极献计献策，这表明基于PBL法结合农业生产实际问题设计的教学实践促进了学生的独立思考能力，提升学生的参与度和学习的主动性。由此可见，基于PBL法结合农业生产实际问题设计的教学方法是一种有效的教学策略，值得在大农学专业中进一步探索和应用。

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基金资助:国家自然科学基金面上项目(31972115); 广东省高等教学学会“十四五”规划2022年度高等教育研究课题:科教融合理念下双一流高校基础实验课教学创新研究(22GQN11); 中国农学会教育教学类课题“基于科教融合的研究型实验教学模式探索与实践”(PCE2215); 华南农业大学本科教学质量与教学改革工程项目(JG2023005);

文章来源:张雪莲,孟雪,李楠,等.“环境影响番茄果实色泽变化”实验的PBL教学实践[J].生物学杂志,2024,41(05):115-121.