骨关节炎是一种临床常见的慢性退行性关节疾病，其特征是关节软骨的丧失和退化以及滑膜炎症，进而导致关节僵硬、肿胀、疼痛和活动能力的丧失[1]。补肾活血方(Bushen Huoxue formula，BSHXF)出自《伤科大成》，以“肾主骨，生髓”“血行则瘀自去”等理论为依据，是治疗筋骨酸痛无力症的经典方剂。已有临床研究证实BSHXF治疗骨关节炎安全有效[2-3]。骨关节炎作为一种炎性病变，其发生发展过程中有多种炎症细胞因子参与[4]。网络药理学研究BSHXF治疗骨关节炎的机制表明，抗炎、抗氧化和减少软骨下的骨破坏可能是其重要机制，且核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)信号通路可能与其作用机制密切相关[5]。

软骨细胞过度凋亡是软骨退变的关键因素之一[6]。细胞凋亡途径由B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)蛋白家族控制，该家族促凋亡和促存活蛋白水平的平衡决定细胞生死[7]。线粒体介导的Caspase依赖途径可诱导骨关节炎中软骨细胞凋亡[8]，Caspase-9是哺乳动物体内内源性凋亡途径的启动者[9]。NF-κB信号转导通路影响软骨基质重塑、软骨细胞凋亡、滑膜炎症[10]。正常情况下，NF-κB在细胞质中与抑制蛋白(inhibitor ofκB，IκB)以无活性形式相结合，在白细胞介素(IL)-6等炎性因子刺激下，活化的NF-κB从细胞质转入细胞核，促进骨关节炎相关基因表达，诱导骨关节炎发生与发展[11]。RelA(p65)是NF-κB活化最常见的形式之一[12]，p65和IκBα磷酸化导致NF-κB转位入核，调节相关基因转录[13]。因此，本研究通过脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导构建软骨细胞炎症模型，体外实验观察BSHXF含药血清对LPS诱导的C28/I2人正常软骨细胞炎症及细胞凋亡的影响及可能分子机制，探讨BSHXF治疗骨关节炎的作用机制，为其治疗骨关节炎提供新的理论依据。

1、材料

1.1实验动物与细胞

SPF级雄性BALB/c小鼠12只，6周龄，体重(22±2)g[湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004，动物使用许可证号：SYXK(湘)2019-0009]。饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心，且通过动物实验伦理委员会审批(伦理批号：LL2022111702)。C28/I2人正常软骨细胞株(上海中乔新舟生物科技有限公司)。

1.2试药

BSHXF(熟地黄10 g、补骨脂10 g、菟丝子10 g、杜仲3 g、枸杞子3 g、当归尾3 g、山茱萸3 g、肉苁蓉3 g、没药3 g、独活3 g、红花2 g)，由湖南中医药大学第二附属医院药剂科提供；取适量处方组成药物置夹层提取罐加水提取两次，两次药液过滤去渣，浓缩滤液成每毫升相当于1.0 g生药的浓度，灭菌、密封、冷藏备用。RPMI-1640培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司)；LPS、二甲基亚砜(DMSO)(北京Solarbio公司)；胎牛血清(FBS)(南京Wisent公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天公司)；CCK-8试剂盒(美国Sigma公司)；乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒(泉州睿信生物公司)；诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶2(COX2)ELISA试剂盒(武汉华美生物公司)；TUNEL试剂盒(赛维尔生物公司)；青霉素-链霉素(100×)液体、超敏ECL化学发光试剂盒(苏州新赛美公司)；Cleaved-Caspase-9、p-IκBα、IκBα抗体(美国Affinity公司)；Bcl-2、Bax、p65、GAPDH抗体(武汉三鹰公司)；p-p65抗体(美国Abcam公司)。

1.3仪器

台式高速冷冻离心机(HealForce公司)；二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；生物安全柜(江苏苏净安泰公司)；离心机(上海卢湘仪公司)；酶标仪(美国PerkinElmer公司)；荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；化学发光成像系统(上海天能科技有限公司)。

2、方法与结果

2.1含药血清制备

12只雄性BALB/c小鼠适应性饲养1周后，按体重随机分为空白血清组、BSHXF含药血清组，每组6只。药物剂量参照人与动物之间体表面积折算的等效剂量比值表，人与小鼠换算系数为0.0026，含药血清组按照6.89 g/(kg·d)剂量给予BSHXF灌胃，空白血清组予以等体积蒸馏水，每日2次，连续灌胃7 d，末次灌胃12 h后，使用10%水合氯醛按照4 mL·kg-1剂量腹腔注射麻醉小鼠，腹主动脉采血，4℃下3000 r·min-1离心15 min分离血清，56℃水浴30 min灭活。灭活后用0.22μm滤膜过滤，-80℃低温保存备用。

2.2细胞培养及分组

将C28/I2正常人软骨细胞在含有10%FBS、100 U·mL-1青霉素和100μg·mL-1链霉素的RPMI-1640培养基中传代培养。细胞分为空白组(Blank组)、LPS模型组(LPS组)、LPS+BSHXF组。Blank组只添加RPMI-1640培养基和10%空白血清；LPS组添加含10μmol·L-1LPS和10%空白血清的RPMI-1640培养基培养；LPS+BSHXF组添加含10μmol·L-1LPS和10%含药血清的RPMI-1640培养基培养。各组均置于37℃，5%CO2培养箱中培养48 h。

2.3 CCK-8法检测BSHXF对软骨细胞活力的影响

按“2.2”项下方法分组干预后，软骨细胞接种于96孔板中(100μL/孔)，每孔细胞数5×103个，置于培养箱中分别培养24、48、72 h后，每个时间点取出一块96孔板，每孔分别加入10μL CCK-8溶液，混匀，孵育2 h，酶标仪检测450 nm处的吸光度(OD)值。结果表明，细胞培养24 h，各组间细胞活力比较差异无统计学意义(P>0.05)。培养48、72 h，与Blank组比较，LPS组细胞活力降低(P<0.01)；与LPS组比较，LPS+BSHXF组细胞活力升高(P<0.01)，见图1。

图1补肾活血方对软骨细胞的细胞活性的影响(x¯±s，n=3)Fig 1 Effect of BSHXF on the activity of chondrocyte(x¯±s，n=3)

2.4 LDH法检测BSHXF对软骨细胞的毒性

按“2.2”项下方法分组干预后，软骨细胞接种于96孔板中(100μL/孔)，每孔细胞数5×103个，加入LDH释放试剂，反复吹打混匀，孵育1 h，离心，每孔分别取上清液120μL，加入至新的96孔板相应孔中，检测细胞上清液中LDH水平。结果表明，与Blank组比较，LPS组细胞液中LDH水平升高(P<0.01)；与LPS组比较，LPS+BSHXF组细胞上清液中LDH水平降低(P<0.01)，见表1。

表1各组软骨细胞上清液LDH水平(n=3)

2.5 ELISA法检测BSHXF对IL-6、iNOS、COX2水平的影响

软骨细胞按“2.2”项下方法处理后，收集各组细胞培养液上清液，按ELISA试剂盒说明书处理样本，酶标仪检测各组细胞培养液上清液IL-6、iNOS、COX2水平。结果表明，与Blank组比较，LPS组软骨细胞培养基上清液中IL-6、iNOS、COX2水平均升高(P<0.01)，而LPS+BSHXF组IL-6、iNOS、COX2水平均降低(P<0.01)，见图2。

图2补肾活血方对炎症因子水平的影响

2.6 TUNEL染色法检测BSHXF对软骨细胞凋亡的影响

按“2.2”项下方法处理后，取各组细胞，细胞爬片甩干后，浸入破膜液中进行细胞通透处理，PBS洗3次，加Buffer常温孵育10 min。加TUNEL反应液，培养箱孵育1 h，PBS洗3次，滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min，PBS洗3次，用抗荧光淬灭封片剂封片，置于倒置荧光显微镜下计数并拍照，阳性凋亡细胞核为绿色，计算TUNEL阳性率。结果表明，与Blank组比较，LPS组软骨细胞凋亡率升高(P<0.01)；与LPS组比较，LPS+BSHXF组软骨细胞凋亡率降低(P<0.01)，见图3。

图3补肾活血方对软骨细胞凋亡的影响(TUNEL染色，×200，

2.7 Western blot检测BSHXF对Cleaved-Caspase-9、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

按“2.2”项下方法处理后，收集各组细胞，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白含量。SDS-PAGE电泳后转膜，封闭1 h后加入Cleaved-Caspase-9(1∶800)、Bcl-2(1∶2000)、Bax(1∶5000)、GAPDH(1∶50 000)一抗4℃孵育过夜；取出膜，洗涤后封闭，二抗(1∶6000)室温孵育2 h；取出膜，清洗，滴加发光液，曝光显色，获取各蛋白条带灰度值。结果表明，与Blank组比较，LPS组软骨细胞中促凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-9和Bax表达升高(P<0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2降低(P<0.01)；与LPS组比较，LPS+BSHXF组Cleaved-Caspase-9和Bax降低(P<0.01)，Bcl-2升高(P<0.01)，见图4。

图4补肾活血方对软骨细胞凋亡蛋白表达的影响(

2.8 Western blot检测BSHXF对NF-κB信号通路关键蛋白表达的影响

按“2.2”项下方法处理后，取收集各组细胞，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白含量。SDS-PAGE电泳后转膜，封闭1 h后4℃孵育一抗稀释液p-IκBα(1∶1000)、IκBα(1∶1000)、p-p65(1∶1000)、p65(1∶1000)、GAPDH(1∶50 000)过夜；取出膜，洗涤后封闭，二抗(1∶6000)室温孵育2 h；取出膜，清洗，滴加发光液，曝光显色，获取各蛋白条带灰度值。与Blank组比较，LPS组p-IκBα/IκBα、p-p65/p65比值升高(P<0.01)；与LPS组比较，LPS+BSHXF组p-IκBα/IκBα、p-p65/p65比值降低(P<0.01)，见图5。

2.9统计学方法

应用SPSS 26.0软件统计分析，实验数据以均数±标准差(x¯±s)表示，方差齐时，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法，P<0.05表示差异具有统计学意义。

3、讨论

BSHXF有补肾活血化瘀的功效，方中熟地黄、杜仲、枸杞子、补骨脂、菟丝子填精补髓，壮阳生精，以补肾为君；红花、没药、当归尾、独活以活血化瘀、行气止痛为臣，使“瘀血去，新血生”，筋骨得养，血脉通畅，而痛自除；再佐以山茱萸以健脾生血，使气血生化有源；使以肉苁蓉润燥、滑肠。诸药配伍，散中有收，收中有散，补泻同施，以达补肾、活血、化瘀之功。现代药理研究结果证实，BSHXF中主要药材成分具有抗炎作用。补骨脂有效成分异补骨脂素能减少滑膜组织中M1和M2巨噬细胞的比例，减少炎症因子的分泌[14]。刘元豪等[15]研究表明杜仲通过上调miR-127-5p的表达抑制骨关节炎软骨细胞增殖及炎症反应。杜仲多糖作为杜仲的主要活性成分之一，可抑制IL-1β诱导的小鼠软骨细胞凋亡、炎症反应和基质降解，减轻软骨细胞损伤[16]。张天栋等[17]研究表明，菟丝子的活性有效成分芝麻素通过抑制IL-1β诱导的NF-κB信号通路降低COX2的表达，达到改善骨关节炎炎症的作用。

研究表明，BSHXF能减缓软骨损伤、缓解关节疼痛肿胀、阻止软骨基质破坏，改善关节软骨内代谢环境[18-19]。本实验中软骨细胞活力、细胞毒性及TUNEL染色实验结果显示BSHXF含药血清可提升LPS诱导的损伤软骨细胞的活性、减轻软骨细胞的毒性、降低软骨细胞凋亡率，从宏观角度初步验证了其疗效。课题组前期动物实验研究发现，BSHXF可显著降低膝骨关节炎小鼠血清中IL-6、iNOS和COX2炎症因子水平，抑制软骨细胞凋亡及细胞外基质降解，从而缓解膝骨关节炎(KOA)疾病进展[20]。IL-6是骨关节炎发病机制中最重要的炎症因子之一[21]，其在骨关节炎患者的滑膜液中高表达[22]。此外，炎症因子激活软骨巨噬细胞，刺激破骨细胞增殖和分化，进而促进代谢介质分解，导致关节炎症和疼痛[23]。巨噬细胞中iNOS和COX2诱导一氧化氮(NO)过度表达在炎症的发展中起着关键作用[24]。iNOS和COX2是调控炎症反应的关键因子，iNOS是NO合成的限速酶，主要对机体产生生物学效应，NO能促进炎症细胞因子COX2的释放，而COX2是加重炎症反应的关键酶[25]。在本研究中，从细胞学层面确定BSHXF含药血清可显著降低LPS诱导的软骨细胞IL-6、iNOS和COX2炎症因子水平，说明其软骨保护作用机制与抑制炎性因子表达有关。

近年，骨关节炎治疗的策略已转向早期预防，在发生软骨破坏之前阻止或延迟疾病进展，因此，抑制过度软骨细胞凋亡在骨关节炎治疗中尤为重要[26]。软骨细胞是软骨中唯一存在的细胞类型，生理状态下其增殖和凋亡处于动态平衡，其存活失调可能导致软骨的破坏[27]。软骨细胞在Caspase、Bcl-2蛋白家族等媒介下，在NO、IL-1β、TNF-α等诱导剂作用下，通过MAPKs、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin、NF-κB等通路诱发细胞凋亡，从而促进骨关节炎形成[28]。本研究发现BSHXF含药血清通过调控凋亡相关蛋白表达抑制软骨细胞凋亡。微观角度证明了BSHXF含药血清缓解软骨退变机制与抑制软骨细胞凋亡有关，进一步验证了其疗效。

NF-κB信号通路参与机体的炎症反应、增殖与凋亡等过程[29]，其异常激活，导致促炎细胞因子过量，进而破坏骨稳态[27]。因此，本研究进一步对NF-κB通路活化相关蛋白的表达进行检测，结果发现BSHXF含药血清可降低p-IκBα/IκBα、p-p65/p65比值，说明BSHXF可能是通过抑制NF-κB通路，减少炎性因子释放、抑制软骨细胞凋亡，发挥软骨保护作用。

本研究具有一定的局限性，对BSHXF含药血清作用于软骨细胞未做量效研究，只进行了一个剂量的研究；未考虑其作用于软骨细胞的时效性，只进行了单一时间点研究。此外，已有研究证实BSHXF治疗骨关节炎有效[18-19]，但具体机制尚不清楚，本研究侧重于机制研究，因此未设置阳性对照组。BSHXF组成成分复杂，相关方药的有效成分对通路的调控机制尚不清楚，仍需进一步研究。

图5补肾活血方对软骨细胞p-IκBα/IκBα及p-p65/p65比值的影响(

参考文献:

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[15]刘元豪,邢忠,许环顺,等.杜仲调控miR-127-5p对骨关节炎软骨细胞增殖､凋亡及炎症因子的影响[J].中国老年学杂志,2023,43(15):3794-3797.

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基金资助:湖南省自然科学基金医卫行业联合基金项目(No.2024JJ9452);湖南省中医药管理局一般项目(No.B2024084;No.D2022114);湖南省中医重点专科建设项目——中药学(湘中医药函[2023]4号);

文章来源:刘小丽,章铮,姚金龙,等.补肾活血方对脂多糖诱导的软骨细胞炎症损伤的影响[J].中南药学,2024,22(09):2275-2280.