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芍药苷调控血管内皮生长因子对小鼠宫颈癌组织病理变化影响

2024-10-08 10 上传者：管理员

摘要：目的探讨芍药苷通过靶向调控血管内皮生长因子（VEGF）对宫颈癌移植瘤小鼠肿瘤组织病理变化的影响。方法将小鼠随机分为模型组（构建宫颈癌移植瘤小鼠模型）、芍药苷组(建模后给予100 mg•kg-1芍药苷)、Vector组(建模后给予100 mg•kg-1芍药苷+瘤体注射Vector质粒)、VEGF组(建模后给予100 mg•kg-1芍药苷+瘤体注射过表达VEGF质粒),建模成功后每隔7 d测量肿瘤体积，用免疫组化法检测肿瘤微血管密度（MVD）,用蛋白质印迹法检测肿瘤组织增殖、凋亡及转移相关蛋白的表达水平，用原位末端转移酶标记法检测肿瘤组织的细胞凋亡率。结果模型组、芍药苷组、Vector组和VEGF组建模成功后第28天的肿瘤体积分别为（1 025.50±81.38）、（722.89±49.67）、（720.36±64.01）和（946.79±89.77） mm3,CD34-MVD水平分别为118.92±6.93、71.67±7.45、72.14±5.55和86.74±8.86,VEGF蛋白相对表达水平分别为1.08±0.09、0.56±0.09、0.54±0.06和0.88±0.13,细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）蛋白相对表达水平分别为0.93±0.14、0.44±0.03、0.46±0.07和0.81±0.09,基质金属蛋白9（MMP-9）蛋白相对表达水平分别为1.17±0.12、0.62±0.07、0.64±0.08和0.90±0.07,细胞凋亡率分别为（4.13±0.47）%、（22.16±2.84）%、（21.24±3.42）和（8.60±0.96）%;芍药苷组的上述指标与VEGF组和模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义（均P<0.01）。结论芍药苷可能通过调节VEGF的表达来抑制血管生成，改变肿瘤组织病理学变化，抑制肿瘤生长，从而缓解小鼠宫颈癌进程。

关键词：
宫颈癌
抗血管生成
组织病理
芍药苷
血管内皮生长因子
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宫颈癌是全球第4大常见的女性癌症。据报道，宫颈癌每年死亡率超过30万人，其对全世界妇女的健康构成严重威胁[1]。芍药苷是从芍药根部提取的主要活性成分，其在治疗恶性妇科相关肿瘤中具有较大潜力[2-3]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是促进血管生成的主要因素之一，其表达与宫颈癌淋巴转移、生存率均显著相关[4]。本研究旨在探究芍药苷调控VEGF对宫颈癌小鼠肿瘤组织病理改变的影响。

1、材料与方法

1材料

动物SPF级雌性C57BL/6小鼠，鼠龄5～6周，体质量18～20 g,购自郑州大学(河南省实验动物中心)。动物生产许可证号：SCXK(豫)2022-0001。本实验经商丘医学高等专科学校伦理委员会批准(伦理批号：20231009)。

细胞人宫颈癌HeLa细胞，购自美国ATCC公司。

药品与试剂芍药苷，规格：每瓶20 mg,纯度：98%,批号：240116,成都普思生物科技股份有限公司生产。过表达质粒，均由上海碧云天公司合成；小鼠免疫组化检测试剂盒，上海翌圣生物科技股份有限公司生产；VEGF一抗，美国Gibco公司生产；CD34、细胞核相关抗原Ki67(nuclear associated antigen Ki67,Ki67)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、基质金属蛋白2(matrix metalloprotein 2,MMP-2)、MMP-9、波形蛋白(Vimentin)、上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)一抗，均购自美国Abcam公司；苏木精-伊红(hematoxylin eosin, HE)染色液，购自上海科拉曼试剂有限公司；原位末端转移酶标记法(TdT mediated dUDP nick end labeling, Tunel)试剂盒，购自上海碧云天生物公司。

仪器M205 FA & M205 FCA显微镜，德国徕卡公司产品；Bolt TM Bis-Tris Plus预制凝胶蛋白电泳系统，美国赛默飞世尔公司产品。

2实验方法

2.1细胞培养[5]

HeLa细胞培养在RPMI-1640培养基中，培养基中添加10%胎牛血清和1%青-链霉素，并置于37℃,5%CO2恒温培养箱中培养，隔天更换培养基。

2.2模型构建[6]

取HeLa细胞，胰酶消化后，调整细胞密度，皮下(右前肢腋下)接种2×106个细胞(细胞悬液150μL),皮下肿瘤体积≥150 mm3时即为建模成功，共建模成功44只。每隔7 d用游标卡尺测量肿瘤长和宽，并计算肿瘤体积[体积(mm3)=长×宽2/2]。

2.3动物分组与给药方法

将建模成功的小鼠随机分为模型组、芍药苷组、Vector组和VEGF组，每组11只。所有组小鼠均按照“2.2”中方法进行建模，在建模成功后，芍药苷组小鼠每天灌胃给予100 mg·kg-1的芍药苷；Vector组小鼠每天灌胃100 mg·kg-1的芍药苷，并根据文献[7]的方法每2 d肿瘤内多点注射Vector质粒(15μg);VEGF组小鼠每天灌胃100 mg·kg-1的芍药苷，并每2 d在肿瘤内多点注射VEGF过表达质粒(15μg);模型组小鼠灌胃等量的蒸馏水并瘤内注射等量的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS);芍药苷组小鼠瘤内注射等量的PBS。每隔7 d检测肿瘤体积，连续治疗4周后处死小鼠并完全解剖肿瘤组织，测量肿瘤质量后进行后续实验。

2.4蛋白质印迹法检测肿瘤组织中VEGF及相关蛋白的表达水平[8]

取肿瘤组织，剪碎后加入液氮研磨，用RIPA裂解液混匀后离心去上清液即为总蛋白溶液，用BCA试剂盒检测总蛋白浓度，取适量蛋白样品变性后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，结束后转膜，封闭后滴加一抗稀释液，4℃冰箱孵育过夜，二抗试剂在室温下孵育90 min,清洗后滴加显影液进行曝光，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参分析灰度值。

2.5 HE染色法观察肿瘤组织病理变化

取肿瘤组织，用4%多聚甲醛进行固定、脱水和透化后浸蜡包埋后切片(4μm),取石蜡组织切片，参考文献[9]方法进行HE染色，在显微镜下观察。

2.6 Tunel实验法检测肿瘤组织细胞的凋亡情况

按照“2.5”中步骤制备肿瘤组织切片，取石蜡组织切片，按参考文献[10]的方法进行Tunel染色，在显微镜下观察并采集图像，并计算凋亡率。

2.7免疫组化法检测肿瘤组织CD34-肿瘤微血管密度(microvascular density, MVD)[8,11]

取部分瘤体组织，进行固定、脱水和透化后进行石蜡包埋，并制片；取切片脱蜡至水化后，加入3%过氧化氢试剂进行抗原修复，用3%牛血清蛋白37℃恒温封闭30 min;滴加CD34一抗(1∶2 500)试剂，4℃孵育过夜，滴加二抗试剂，37℃培养箱孵育60 min,滴加DAB显色液显色，用苏木精试剂复染3 min后冲洗干净，梯度乙醇脱水后透明并封片，在显微镜下观察，并以CD34标记的血管内皮细胞计算MVD,随机选取5个视野，用Image J软件对每张切片视野下的微血管数目进行计数并取平均值。

3统计学处理

用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料用表示，多组间比较用单因素方差分析，2组间比较用独立样本t检验。

2、结果

1芍药苷对宫颈癌小鼠VEGF表达的影响

模型组小鼠构建宫颈癌移植瘤小鼠模型，芍药苷组建模后给予100 mg·kg-1芍药苷，Vector组建模后给予100 mg·kg-1芍药苷+瘤体注射Vector质粒，VEGF组建模后给予100 mg·kg-1芍药苷+瘤体注射过表达VEGF质粒。

模型组、芍药苷组、Vector组和VEGF组的VEGF蛋白相对表达水平分别为1.08±0.09、0.56±0.09、0.54±0.06和0.88±0.13。芍药苷组及Vector组肿瘤组织中VEGF蛋白相对表达水平均较模型组显著降低(均P<0.01);VEGF组与Vector组比较，VEGF蛋白相对表达水平显著升高(P<0.01)

2芍药苷介导VEGF对宫颈癌小鼠肿瘤生长的影响

模型组、芍药苷组、Vector组和VEGF组建模成功后28 d的肿瘤体积分别为(1 025.50±81.38)、(722.89±49.67)、(720.36±64.01)和(946.79±89.77)mm3,肿瘤质量分别为(1.62±0.13)、(0.85±0.08)、(0.83±0.12)和(1.40±0.13)g;芍药苷组及Vector组建模成功后28 d的肿瘤体积及质量均较模型组显著降低(均P<0.01);VEGF组与Vector组比较，建模成功后28 d的肿瘤体积及质量均显著降低(均P<0.01)。

3芍药苷介导VEGF对肿瘤组织病理学改变的影响

HE染色结果显示：模型组和VEGF组小鼠肿瘤组织癌细胞较为密集、饱满，核质较多，无明显坏死区，染色较深，出现多个癌巢；芍药苷组的癌细胞均较模型组、VEGF组出现不同程度的坏死，见图1。

4芍药苷介导VEGF对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响

由表1可见：芍药苷组及Vector组小鼠Ki67、Cyclin D1、Bcl-2蛋白相对表达水平均较模型组显著降低，Bax蛋白相对表达水平和细胞凋亡率均模型组显著升高(均P<0.01);VEGF组与Vector组比较，肿瘤组织Ki67、Cyclin D1、Bcl-2蛋白相对表达水平均显著升高，Bax蛋白相对表达水平及细胞凋亡率均显著降低(均P<0.01)。

5芍药苷介导VEGF对肿瘤MVD及细胞转移的影响

芍药苷组及Vector组小鼠MMP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin蛋白相对表达水平及MVD水平均较模型组显著降低，E-cadherin蛋白相对表达水平均较模型组显著升高(均P<0.01);VEGF组与Vector组比较，肿瘤组织MMP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin蛋白相对表达水平及MVD水平均显著升高，E-cadherin蛋白相对表达水平均显著下降(均P<0.01),见表2。相关性分析显示(如图2所示):MMP-2和MMP-9表达水平与MVD水平均呈显著正相关(均P<0.01)。

图1用苏木精-伊红(HE)染色法观察各组大鼠肿瘤组织病理学变化(×200)

表1各组小鼠增殖、凋亡相关蛋白及凋亡率的比较

表2各组小鼠CD34-肿瘤微血管密度(MVD)水平及转移相关蛋白表达的比较

图2基质金属蛋白2(MMP-2)、MMP-9与CD34-MVD水平的相关性分析

3、讨论

芍药苷是一类具有抗炎、镇静等多种功效的天然化合物，其在妇科相关性肿瘤中具有良好的抗肿瘤作用。高天勤等[12]研究表明，芍药苷可以通过阻断核因子-κB通路在体外抑制卵巢癌细胞的凋亡和迁移。VEGF作为肿瘤血管生成的重要因子在宫颈癌的发病和进展中发挥了重要的作用，靶向VEGF的治疗药物，为宫颈癌的传统化疗提供了新的替代策略，其可通过抑制新血管的形成，在提高宫颈癌患者的生存率上具有一定的作用[13]。本研究中，宫颈癌移植瘤小鼠肿瘤组织中VEGF蛋白相对表达水平显著升高，经芍药苷治疗后，肿瘤组织中VEGF蛋白相对表达水平明显受到抑制。已有研究显示，芍药苷可能通过抑制新血管生成在肿瘤生长中发挥作用[14],本研究的结果与之相似。上述结果提示，芍药苷可能通过靶向调节VEGF介导新血管生成发挥其抑癌作用。

本研究通过构建宫颈癌小鼠移植瘤模型观察芍药苷对肿瘤生长的影响，结果发现，芍药苷可显著减缓宫颈癌小鼠体内肿瘤生长的速度；HE染色结果也观察到，经芍药苷治疗后，宫颈癌小鼠肿瘤组织癌细胞坏死区域增多，高表达VEGF后，可明显削弱芍药苷对肿瘤生长的抑制作用；蛋白质印迹实验结果还发现，芍药苷可显著抑制肿瘤组织中Ki67、CyclinD1、Bcl-2表达，促进Bax表达。其中，Ki67和CyclinD1是细胞增殖的标记物，是参与细胞周期进展的重要调控因子，促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2相互拮抗调控细胞凋亡[15]。此外，本研究结果还发现，芍药苷对Ki67、CyclinD1、Bcl-2、Bax的表达调控作用以及细胞凋亡率的诱导作用均被过表达VEGF后削弱，这提示芍药苷可以通过抑制VEGF抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡。

检测MVD是临床和实验室中用于评估血管生成的标准方法。肿瘤MVD既反映肿瘤组织的血管生成状况还预示着肿瘤的生长和迁移，CD34是MVD的生物标志物[16]。本研究用CD34标记宫颈癌小鼠肿瘤组织检测MVD水平，结果发现，经芍药苷治疗后可显著降低肿瘤组织中MVD的水平，而过表达VEGF可以减弱芍药苷对MVD的抑制作用，提示芍药苷可能通过靶向VEGF的表达发挥其抗血管生成作用。肿瘤血管生成的过程不仅包括新生血管的形成，还包括基底膜形成等多种过程，其中Ⅳ型胶原是基底膜的主要结构蛋白，MMP-9和MMP-2是降解Ⅳ型胶原的重要酶，因此MMP-9和MMP-2与肿瘤血管生成密切相关[17]。本研究结果发现，肿瘤组织中MMP-9和MMP-2的表达水平与MVD水平均呈显著正相关，这与王中奇等[17]的研究一致。此外，有研究表明，MMP-9和MMP-2的高表达还与肿瘤细胞的迁移和侵袭相关[18]。本研究结果发现，芍药苷治疗后可以显著抑制MMP-9、MMP-2、Vimentin、N-cadherin表达，并促进E-cadherin的表达，过表达VEGF逆转了芍药苷对MMP-9、MMP-2、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin表达的调控作用，这提示芍药苷可通过VEGF介导血管生成途径来抑制肿瘤细胞的转移。

参考文献:

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文章来源:程亚,高伟,王钟辉.芍药苷调控血管内皮生长因子对小鼠宫颈癌组织病理变化的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(19):2875-2879.