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流感样病例中的病毒载量对流感病毒分离效果的影响

2024-08-27 5 上传者：管理员

摘要：目的分析流感样病例标本中的病毒载量对流感病毒分离效果的影响,从而提高流感病毒分离工作的质量和效率。方法 2023年1-10月,在区哨点医院和周边区县收集320例核酸阳性流感样病例标本,采用吸附法和直接接种法接种于狗肾传代细胞中,比较流感病毒分离效率;再以实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）中的Ct值为界,划分为3组进行对比;对相关因素进行分析。结果不同性别流感病毒细胞分离结果差异无统计学意义（直接接种法:χ2=0.676,P>0.05;吸附法:χ2=1.359,P>0.05）。采用直接接种法分离出的流感阳性毒株数明显高于吸附法,差异有统计学意义（χ2=20.516,P<0.05）。Ct值越低,流感病毒分离阳性率越高,不同Ct值分离阳性率差异有统计学意义（直接接种法:χ2=35.594,P<0.05;吸附法:χ2=15.496,P<0.05）。不同接种方法中,甲型流感亚型H3N2和新甲H1N1分离的流感病毒阳性率差异无统计学意义（直接接种法:χ2=1.563,P>0.05;吸附法:χ2=1.214,P>0.05）。结论在流感病毒细胞分离实验中,采用直接接种法,选取流感病毒载量高（Ct值<30）的标本可以有效提高流感病毒分离阳性率。

关键词：
流感病毒
流行性感冒病毒
病毒分离
病毒载量
细胞培养
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流行性感冒（简称流感）是由流行性感冒病毒（简称流感病毒）引起的一种急性呼吸道传染病。主要症状表现为高热、头痛、全身肌肉酸痛、咳嗽、乏力等。流感病毒由于具有极强变异性和传染性，人们普遍易感，对老幼体弱人群极易引起并发症、甚至致命危险。流感是第一个实施全球监测的传染病，也是迄今为止都无法完全加以控制的一种呼吸道病毒性传染病。据世界卫生组织发布的数据显示，全球每年流感病例有6亿～12亿，死亡50万～100万人，其中重症流感病例是300万～500万例，重症流感的死亡率为8%～10%[1-3]。流感病毒属于正粘病毒科，为单股负链RNA病毒。根据核蛋白和基质蛋白的不同，流感病毒可以分为甲、乙、丙3个型别。其中甲型流感病毒可依据血凝素和神经氨酸酶分为不同的亚型，主要是甲型H1N1和季节性H3N2，乙型流感病毒被分为Victoria和Yamagata 2种[4]。目前治疗流感的相关药物较少且开始出现耐药性变异，注射流感疫苗是防止流感大规模暴发的最有效手段。

病毒分离培养是流感样病例病原学监测的基础，是流感病毒检测最常用和最可靠的方法之一。目前多采用鸡胚和狗肾传代细胞（Mardin-Darby canine kidney,MDCK）进行流感病毒分离，通过鸡胚分离的流感毒株与原始标本的抗原性和基因特性可能会有所不同。而通过MDCK细胞所分离的流感病毒与原始标本相似，因此细胞培养获得的纯毒株，更有利于对流感病毒抗病毒药物敏感性进行分析及疫苗研究[5]。本次实验通过研究标本中流感病毒载量对病毒分离效果的影响，为实际工作中优化、提高流感病毒分离效率提供科学依据，为病毒学疾病的诊断、疫苗制备以及基础理论研究提供技术支持。

1、材料与方法

1.1标本来源

根据《全国流感监测技术指南（2017版）》[6],2023年1-10月，通过区哨点医院和本区及周边几个区县的流感暴发疫情收集符合要求的流感样病例标本。采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）对这些标本进行核酸检测，获得核酸阳性标本共计320例。

1.2主要试剂及仪器

胎牛血清、青链霉素双抗溶液、1640基础培养基、PBS缓冲液、0.25%胰酶均购自美国Gbico公司；TPCK胰酶购自美国Sigma公司；1.0%人“O”型红细胞悬液由本实验室自行配置；甲型/乙型流感病毒核酸检测试剂盒、季节性流感病毒H3N2核酸检测试剂盒、甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盒均购自江苏硕世生物技术有限公司；流感核酸检测所用仪器为购自美国BIO-RAD公司的CFX96系列实时荧光定量PCR仪；二氧化碳培养箱购自ESCO;T25细胞培养瓶购自康宁公司。

1.3 MDCK细胞培养

细胞生长液成分：1640基础培养液，20%胎牛血清，青霉素、链霉素终浓度100 U/m L,4℃保存。将从重庆市疾控中心微生物检测所获得的MDCK细胞，放置在37℃二氧化碳培养箱中培养，次日更换新鲜配置的细胞生长液，继续培养。待单层细胞铺满T25细胞培养瓶后用PBS缓冲液清洗2次，0.25%胰酶消化并传代。如此反复，当细胞瓶数达到足够量后，挑选含有75%～90%成片细胞，且生长状态良好的细胞，准备流感病毒接种，剩余细胞继续传代培养。

1.4接种方法

病毒生长液成分：1640基础培养液，胰酶终浓度2μg/m L，青霉素、链霉素终浓度100 U/m L,4℃保存。

1.4.1直接接种法

将符合要求的细胞弃生长液，PBS清洗2次，处理好的标本液取1 m L接种至细胞瓶中，拧紧瓶盖，轻晃瓶身至液体铺平细胞层；置37℃恒温培养箱吸附1.5 h，再加病毒生长液5 m L，轻晃混匀，置34℃恒温培养箱培养。

1.4.2吸附法

将生长好的细胞用PBS清洗2次后，接种1 m L标本液，置37℃恒温培养箱吸附1.5 h，吸出接种物并用PBS洗涤1次，加病毒生长液5 m L，轻晃混匀，置34℃恒温培养箱培养。

1.5病毒载量对流感病毒分离效果的影响

在相同实验条件下，同时采用2种接种方法将核酸检测结果阳性的流感样病例标本分别接种到MDCK细胞中，以阈值循环（cycle threshold,Ct）值为界，分为<30、30～<33、33～这3组进行结果比较。不能及时接种的标本存放在-70℃冰箱，避免反复冻融。

1.6红细胞凝集试验检测待检病毒滴度

72 h后观察接种了标本的细胞情况，当75%以上的细胞处于细胞病变（cytopathic effect,CPE）状态时，收获细胞培养上清液，用于后续实验。96孔微量反应板第2～12列加入50μL PBS,A1～H1分别加入100μL待检病毒液，吸取50μL横向二倍列稀释，最后一孔弃去50μL，加入1.0%人“O”型红细胞悬液，混匀，静置60 min，观察并记录结果。结果判定：出现完全凝集的最高稀释度的倒数即为病毒的红细胞凝集滴度。血凝（hemagglutination,HA）试验滴度≥8的直接收获，并用血凝抑制（hemagglutination inhibition,HAI）试验进行鉴定复核；<8的传二代，若仍<8，或无滴度，弃掉。

1.7统计学分析

使用SPSS 19.0软件进行数据处理。计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1不同性别对流感病毒分离效果的影响

共收集到320例核酸阳性流感样病例标本进行流感病毒分离，其中175例为男性，145例为女性，男女比例1.21∶1，主要为小学生和中学生。采用直接接种法和吸附法成功分离出的阳性毒株中，男女分离结果差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 不同性别对流感病毒分离的影响

2.2两种接种方法对流感病毒分离效果的影响

在320例流感样病例核酸阳性标本中，采用直接接种法分离出的流感阳性毒株数高于吸附法，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 两种接种方法对流感病毒分离效果的影响

2.3病毒载量对流感病毒分离效果的影响

流感样病例核酸阳性标本中，不同Ct值的分离阳性率差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 病毒载量对流感病毒分离效果的影响

2.4不同亚型流感病毒分离效果的比较

2023年收集到的流感型别全部为甲型流感，其中新甲H1N1有53例，H3N2有267例。甲型流感不同亚型的流感病毒分离阳性率差异无统计学意义（P>0.05），见表4。

表4 不同亚型流感病毒分离效果的比较

3、讨论

流感病毒为溶细胞型病毒，当细胞被流感病毒感染后，病毒不断在细胞内复制并促使细胞凋亡，从吸附的表面掉落，细胞膜破裂，大量的流感病毒释放到培养上清液中。而流感病毒表面的血凝素抗原，能与人红细胞表面的受体相结合引起凝血反应，因此可以通过血凝试验判断培养上清液中是否存在流感病毒，HA滴度大小与流感病毒的含量成正相关[7]，也通过HA滴度来判断是否成功分离出流感病毒株。

此次研究表明，流感样病例的性别对分离阳性率无影响，可能与流感病毒对人类普遍易感，且在不同人群中的增殖方式和部位一致有关。不同接种方法对分离阳性率有较大影响，吸附法操作步骤多，潜在污染的风险大，且病毒可能还未完全吸附到细胞上就被清洗掉了。直接接种法能够有效避免这些问题，所以分离阳性率高于吸附法。

MDCK细胞分离流感病毒时，培养温度、培养时间、胎牛血清浓度、细胞传代消化时间、病毒吸附时间、胰酶浓度等都会影响细胞生长或病毒与细胞之间相互作用，从而对流感病毒分离效果产生较大影响[8-10]。在日常实验中，选用已经验证过的最优条件进行流感病毒细胞分离培养时，很多时候病毒分离阳性率还是很低。陈家图等[11-12]研究表明，病毒接种量对流感病毒分离阳性率影响较大，但无明确的量化值。通过何种方法简单快速估算病毒接种量，值得进一步研究。新冠疫情之后，病毒载量高低影响基因测序效果已成为业内共识，由此可推，流感样病例标本中病毒含量会对病毒分离效果产生影响。RT-q PCR实验中的Ct值能够反应标本中的病毒载量多少，Ct值越小，病毒载量越高。此次研究以流感样病例标本的核酸检测Ct值进行分组比较，研究流感样病例标本里的病毒载量对病毒分离效果的影响。从2023年2月起，国内多地开始大量出现流感样病例，由于都是呼吸道传播疾病，在新冠“乙类乙管”后，流感再次引起了社会高度关注，同时获得的大量标本为此次研究提供了有利条件。通过分组比较发现，病毒载量高的流感标本在细胞中的分离阳性率明显高于病毒载量低的，当Ct值达到33以上，很难分离出阳性毒株。其原因可能是病毒载量低的标本能够有效感染细胞的病毒数量不足，病毒不能在细胞内大量复制，无法诱导细胞凋亡，分离效果不理想。

2023年之前的研究发现，H3N2亚型流感病毒由于其HA蛋白抗原位点不断发生变异，导致该亚型在MDCK细胞中分离率不断下降[13-16]。特别是在2022年夏季反季节流行期间，H3N2亚型在细胞中的分离阳性率极低，86例仅分离出11株阳性菌株，故本实验室一直在寻找和探索提高流感病毒细胞分离阳性率的方法。2023年流感流行株依然以H3N2亚型为主，但病毒分离阳性率较2022年明显增加，与新甲H1N1分离阳性率无明显差异。这与本研究对标本进行了筛选以及接种方法的改变有很大关系，也可能与结构蛋白的变异有关，值得进一步深入研究。

本研究表明，在以后的流感病毒分离工作中，采用直接接种法，选取病毒载量高即核酸检测Ct值低的标本接种细胞，能够更及时高效地分离出阳性毒株，特别是变异毒株。这对预测流感的发生和流行，流感病毒诊断、疫苗制备和相关药物研究都有着至关重要的作用。

参考文献:

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[6]中国国家流感中心.全国流感监测技术指南(2017版)[EB/OL].

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[9]马萍,李欣玥.流感病毒在狗肾上皮细胞上的最优培养条件[J].现代预防医学,2017,44(23):4326-4331.

[10]裴瑞青,欧新华,李灵之,等.犬肾细胞培养流感病毒条件的优化[J].热带医学杂志,2023,23(2):184-187,202.

[11]陈家图,李晓君,许铭清,等.贴壁MDCK细胞分离流感病毒影响因素研究进展[J].医学动物防制,2020,36(10):948-952.

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[14]罗剑,李秀玲.基于细胞培养的流感疫苗研究进展[J].中国新药杂志,2019,28(21):2594-2599.

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