缺氧性肺动脉高压(hypoxia pulmonary artery hyp-ertension,HPH)是一组由缺氧引起的以肺动脉压力增高并伴有右心室肥大的慢性进行性疾病,其主要病理特征包括肺血管的异常收缩和肺血管结构重建[1,2,3,4]。而慢性缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖是肺血管结构重建发生的重要环节,抑制肺血管平滑肌细胞的增殖可显著缓解HPH,刺激肺血管平滑肌细胞的增殖可导致HPH显著恶化[5,6,7,8,9],因此缺氧诱导的肺血管平滑肌细胞增殖在HPH的发生发展中发挥着重要作用。可见,探究缺氧诱导的肺动脉平滑肌增殖的分子基础及其调控机制可为HPH的防治提供重要的理论依据。

SOCS3是SOCS家族中最活跃一员,参与调节多种细胞因子介导的信号通路,影响细胞的生长、增殖、凋亡等生物学行为。SOCS3通过抑制JAK2/STAT3信号通路来抑制多种细胞增殖[10,11,12,13]。STAT3信号通路的激活可以刺激其下游靶基因cyclinD1、Myc、BCL、VEGF等表达增多进而促进细胞增殖[14]。STAT3信号通路在血管平滑肌细胞增殖调控中也发挥着重要的作用,研究证实抑制STAT3信号通路的激活可有效抑制血管平滑肌细胞的增殖[15,16,17,18],而过表达SOCS3可明显抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖[19]。文献研究和生物信息学分析均证实,SOX6是调控SOCS3基因表达的关键转录因子,SOCS3基因启动子区域具有SOX6的特征识别序列且在物种间高度保守[20]。SOX6是Y染色体性别决定区(sex determination region of Y chromosome, SRY)相关基因家族中的一员,大量研究表明SOX6参与神经发育、软骨形成、骨髓造血、骨骼肌分化等重要的生理过程[21,22]。抑制SOX6的表达可显著刺激多种肿瘤细胞增殖,如:前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞等[23,24,25],提示SOX6在调控细胞增殖中发挥重要的作用,但SOX6-SOCS3在缺氧引起的人肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用及其机制尚未见报道。因此,本研究拟通过小干扰RNA、慢病毒转染过表达等技术探讨SOX6-SOCS3在缺氧诱导的HPASMCs增殖中的作用及机制。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞

原代人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)购自ScienceCell公司,细胞用平滑肌细胞培养基(货号:1101,ScienceCell公司)培养。

1.1.2主要试剂和仪器

小干扰RNA购自锐博生物公司,SOX6干扰序列:si-SOX6-1的靶序列为GAA-CGCGCTTTGAGAATTT;si-SOX6-2的靶序列为AGAT-CCACTTAGAGAAGTA;si-SOX6-3的靶序列为GGGA-AACTGTCCTCCATAA,SOCS3干扰序列:si-SOCS3-1的靶序列为CAGCATCTCTGTCGGAAGA;si-SOCS3-2的靶序列为CACCTGGACTCCTATGAGA。SOX6抗体(货号:ab64946)购自英国Abcam公司;SOCS3抗体(货号:14025-1)购自美国Proteintech公司;p-STAT3抗体(货号:9145)、PCNA抗体(货号:2586S)均购自美国CST公司;CCK-8试剂盒(货号:CK04)购自日本同仁公司;PBS、TBS、封闭蛋白干粉均购自博士德公司;细胞组织裂解液(RIPA)、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG均购自碧云天公司;RNA提取试剂盒(货号:R6834-02)购自美国OMEGA公司;SOX6上游引物5′-GGATGCAATGACCCAGGATTT-3′,下游引物5′-TGAATGGTACTGACAAGTGTTGG-3′,SOCS3上游引物5′-ATCCTGGTGACATGCTCCTC-3′,下游引物5′-GGCACCAGGTAGACTTTGGA-3′,引物由美国Invitrogen公司合成;LipofectamineRNAiMAX(货号:13778-150)购自美国Thermo Fisher Scientific公司;带GFP荧光的SOX6过表达慢病毒由上海吉玛制药技术有限公司设计合成;缺氧工作站购自英国Baker Ruskinn公司。

1.2方法

1.2.1细胞缺氧处理

将HPASMC细胞消化后,取适量单细胞悬液均匀接种到培养皿中,待细胞生长至对数生长期,换液,然后置于缺氧工作站(37℃,4%O2)内分别培养24、48 h后取出进行后续实验,分为3组:常氧组、缺氧24 h组、缺氧48 h组(n=3)。

1.2.2荧光定量PCR检测SOX6和SOCS3的mRNA表达水平

用RNA提取试剂盒提取各组细胞总RNA,测RNA样品的浓度和纯度,使得D(260)/D(280)值在1.8～2.0之间,反转录后得到cDNA,荧光定量PCR检测各组SOX6和SOCS3的mRNA表达,实验重复3次。

1.2.3Western blot法检测细胞中SOX6、SOCS3、PCNA、p-STAT3蛋白的表达

分别收集各组的细胞,用RIPA+PMSF裂解细胞,提取总蛋白,BCA试剂盒进行蛋白定量。SDS-PAGE电泳后,恒流转膜2 h,脱脂奶粉封闭1 h,SOX6抗体(1∶100)、SOCS3抗体(1∶500)、PCNA抗体(1∶1 000)、p-STAT3抗体(1∶500) 4℃孵育过夜,TBST洗膜3次,每次10 min。HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶2 000)、山羊抗鼠二抗(1∶2 000)室温孵育1 h,TBST洗3次,每次10 min,蛋白显像,实验重复3次。

1.2.4小干扰RNA转染细胞

按照说明书将siRNA配成终浓度20μmol/L的工作液,以6孔板为例(96孔板可按比例计算),取450μL Opti-MEM培养液,加入3.75μL的siRNA工作液,加入7.5μL LipofectamineRNAiMAX,混匀后室温静置20 min,然后加入细胞孔内,培养箱内继续培养24 h后,换液,24、48 h后进行相应的处理及检测。干扰SOX6表达分为4组:si-SOX6-NC组(阴性对照组)、si-SOX6-1组、si-SOX6-2组、si-SOX6-3组(n=3),干扰SOCS3表达分为3组:si-SOCS3-NC组(阴性对照组)、si-SOCS3-1组、si-SOCS3-2组(n=3)。

1.2.5 CCK-8检测细胞的增殖能力

消化细胞后,按照每孔5 000个细胞接种在96孔板中,每组设3个复孔,进行转染和缺氧处理。检测前吸干孔内培养基,PBS轻柔洗两遍,每孔加入10μL的CCK-8和90μL PBS,37℃、5%二氧化碳培养箱中培养4 h后,酶标仪450 nm测定吸光度D(450)值,实验重复3次。

1.2.6过表达SOX6肺动脉平滑肌细胞的建立及鉴定

将生长状态良好的HPASMC细胞按105/孔接种到6板中,待细胞融合率约30%时,PBS漂洗细胞3次,更换新鲜培养基,病毒稀释液中加入促转染试剂polybrene(聚凝胺),终浓度为5μg/mL,按照细胞MOI值计算并加入相应量的病毒。将培养基和病毒液充分混匀置于培养箱中孵育48 h,换成新鲜培养基,同时按照1∶1 000的比例加入嘌呤霉素进行筛选。24 h后换液,荧光显微镜下观察转染效率,用于后续实验。分为4组:常氧对照组、过表达SOX6组、缺氧对照组、缺氧+过表达SOX6组(n=3)。

1.3统计学分析

应用SPSS 18.0软件进行统计学分析,各组计量资料数据以x¯±s表示,两组间的比较采用LSD-t检验。

2、结果

2.1缺氧诱导平滑肌细胞增殖,并显著降低SOX6和SOCS3的表达

采用4%O2缺氧处理HPASMCs,CCK-8检测结果显示,与常氧组相比,缺氧24 h组CCK-8相对水平(1.27±0.09)和缺氧48 h组CCK-8相对水平(1.27±0.06)显著升高(P<0.05)。同时,Western blot结果显示缺氧24 h组和缺氧48 h组SOX6、SOCS3的蛋白表达水平显著下降、PCNA蛋白表达水平显著升高(P<0.05,图1),提示SOX6和SOCS3可能参与缺氧引起的肺动脉平滑肌细胞增殖。

图1缺氧对PCNA、SOX6、SOCS3蛋白表达的影响

2.2敲低SOX6或SOCS3的表达可显著增强平滑肌细胞增殖

为了进一步证实SOX6、SOCS3参与调控平滑肌细胞的增殖,分别用siRNA干扰平滑肌细胞中SOX6、SOCS3,采用RT-qPCR及Western blot检测其表达,结果显示,siRNA干扰可显著降低SOX6(P<0.001,图2)或SOCS3(P<0.001,图2)的mRNA和蛋白表达水平。且敲低SOX6后,SOCS3的蛋白和mRNA表达水平显著降低(P<0.05,图3)。CCK-8检测结果显示,与阴性对照组相比,si-SOX6-1组CCK-8相对水平(1.20±0.09)、si-SOX6-2组CCK-8相对水平(1.25±0.06)、si-SOX6-3组CCK-8相对水平(1.25±0.06)、si-SOCS3-1组CCK-8相对水平(1.25±0.04)、si-SOCS3-2组CCK-8相对水平(1.23±0.05)均显著升高(P<0.05),同时PCNA的蛋白水平也明显升高(P<0.01,图4)。证实干扰SOX6或SOCS3表达后,平滑肌细胞的增殖显著增强,表明SOX6、SOCS3参与调控平滑肌细胞增殖。

图2荧光定量PCR与Western blot检测SOX6、SOCS3干扰效率

图3荧光定量PCR与Western blot检测干扰SOX6对SOCS3表达的影响

图4干扰SOX6、SOCS3对PCNA表达的影响

2.3敲低SOX6或SOCS3可促进STAT3磷酸化,诱导平滑肌细胞增殖

为了探究SOX6、SOCS3调控平滑肌细胞增殖背后的机制,在敲低SOX6、SOCS3的平滑肌细胞中,进一步用Western blot检测了p-STAT3的蛋白表达变化。结果显示,在敲低SOX6、SOCS3后,平滑肌细胞中p-STAT3的蛋白表达水平显著升高(P<0.01,图5)。提示常氧条件下敲低SOX6或SOCS3的表达对平滑肌细胞增殖的增强作用是通过促进STAT3磷酸化来实现。

图5敲低SOX6、SOCS3对p-STAT3表达的影响

2.4过表达SOX6可通过抑制STAT3磷酸化阻止缺氧诱导的平滑肌细胞增殖

为了进一步证实SOX6-SOCS3通过抑制STAT3磷酸化来阻止缺氧诱导的平滑肌增殖,采用Western blot检测细胞中p-STAT3蛋白表达水平,结果显示,与常氧组相比,缺氧24 h组细胞p-STAT3蛋白相对表达水平(1.50±0.20)、缺氧48 h组细胞p-STAT3蛋白相对表达水平(2.19±0.22)明显升高(P<0.01,图6)。通过慢病毒转染过表达平滑肌细胞中的SOX6,采用Western blot检测过表达效果,结果显示,与常氧对照组相比,过表达组SOX6的蛋白表达显著升高(P<0.01,图7)。同时,SOCS3的蛋白表达水平也显著升高,PCNA、p-STAT3的蛋白表达水平则明显降低(P<0.01,图7)。为了进一步证实SOX6-SOCS3在调控缺氧诱导的平滑肌细胞增殖中作用及机制,将过表达SOX6的平滑肌细胞置于4% O2的缺氧条件下培养48 h,并进行CCK-8检测,与缺氧对照组相比,缺氧+过表达SOX6组细胞CCK-8相对水平(0.75±0.05)明显降低(P<0.01),过表达SOX6可显著抑制缺氧诱导的平滑肌细胞增殖。且SOX6、SOCS3的蛋白表达水平显著升高,p-STAT3、PCNA蛋白表达水平显著下降(P<0.01,图7)。表明SOX6-SOCS3通过抑制STAT3磷酸化来阻止缺氧诱导的平滑肌细胞增殖。

图6缺氧对平滑肌细胞p-STAT3蛋白表达的影响

图7过表达SOX6对SOX6、SOCS3、PCNA、p-STAT3蛋白表达的影响

3、讨论

缺氧性肺动脉高压是肺源性心脏病、高原肺水肿和高原心脏病等发病的中心环节。因此深入研究缺氧性肺动脉高压的发生机制,制定有效的防治策略,对于改善高原群众和官兵的生存质量具有十分重要的意义。缺氧性肺动脉高压主要病理特征包括缺氧引起的肺血管异常收缩和肺血管结构重建,缺氧诱导的肺动脉平滑肌增殖是肺血管结构重建的重要环节,现有的研究发现血管紧张素-2、内皮素-1、血小板生长因子、内质网-线粒体相关膜的形成等都参与了缺氧诱导的肺血管平滑肌增殖[27,28,29,30]。同时发现,核苷酸结合的寡聚结构域蛋白2(NOD2)的缺失可以通过促进肺血管平滑肌细胞的增殖来恶化缺氧诱导的肺动脉高压[28],白藜芦醇、丹参素、龙葵碱、长链非编码RNA都可以通过抑制肺血管平滑肌细胞的增殖进而改善肺动脉高压[31,32,33]。尽管缺氧诱导的肺动脉平滑肌增殖在缺氧性肺动脉高压的发生中十分重要,但其背后的分子机制仍不十分清楚。SOX6在缺氧诱导的肺动脉平滑肌增殖中的作用尚少见报道。在本研究中我们探讨了SOX6在缺氧诱导的肺动脉平滑肌增殖中的作用及其可能的机制,研究结果发现SOX6通过SOCS3抑制STAT3的磷酸化进而抑制缺氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖,为缺氧性肺动脉高压的发生机制研究提供了一个新的方向,也为干预缺氧诱导的肺动脉平滑肌增殖提供了一个新的靶点。

SOCSs是1997年以来被发现的具有负性调控细胞因子信号通路功能的蛋白家族,目前对SOCS3和SOCS1了解的较为清楚,其广泛表达在不同类型的组织和细胞。已有研究发现,SOCS3可能通过阻止STAT3磷酸化从而抑制缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖[9,10,11,12]。SOX6作为调控SOCS3表达的关键转录因子,参与众多重要的生理过程[12,13]。有文献报道,SOX6在多种肿瘤细胞中作为一种抑癌因子广泛发挥作用[34,36],同时多种micro RNA可通过SOX6来调控肿瘤细胞的增殖、分化和侵袭[35,37]。虽然已经明确SOX6可参与调控肿瘤细胞的增殖,但是关于SOX6调控平滑肌细胞增殖的具体作用和机制研究尚少见报道。本研究结果显示,与常氧组相比,缺氧组细胞中SOX6、SOCS3蛋白表达水平均显著降低,且伴有显著的增殖效应。敲低SOX6、SOCS3表达可显著增强平滑肌细胞增殖。提示SOX6调控细胞增殖的作用可能通过其下游SOCS3来实现。

文献报道,在缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖中,STAT3通路的激活发挥着重要作用,阻断STAT3信号通路可有效抑制血管平滑肌的增殖[15,16,17,18]。STAT3是一种重要的转录因子,其磷酸化可激活STAT3信号通路,在调节细胞增殖方面发挥重要的作用[14]。现有研究发现,SOCS家族蛋白可通过抑制JAK激酶的活性阻断STAT3磷酸化,进而抑制JAK-STAT3通路激活[10,11,12,13]。本研究结果显示,敲低平滑肌细胞中的SOX6、SOCS3可显著上调STAT3的磷酸化水平,缺氧组细胞中STAT3的磷酸化水平显著增高。过表达SOX6可显著降低STAT3的磷酸化水平,同时显著抑制缺氧诱导的增殖。综合比较发现,SOX6可通过SOCS3抑制STAT3信号通路的激活来显著抑制缺氧诱导的肺动脉平滑肌增殖。

综上,增强SOX6-SOCS3的表达可显著抑制缺氧诱导的人肺动脉平滑肌的增殖,其机制与STAT3信号通路抑制密切相关。缺氧下调SOX6、SOCS3表达,进而激活STAT3信号通路刺激细胞增殖可能是缺氧诱导肺动脉平滑肌细胞增殖的分子机制之一。而过表达SOX6可显著抑制缺氧诱导的平滑肌细胞增殖,提示SOX6可作为干预缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖的新靶点。除此之外,SOX6可通过抑制STAT3的磷酸化来阻止STAT3信号通路的激活,STAT3信号通路的激活与中枢神经系统疾病、肿瘤、心血管系统疾病等有着密切的关系,提示SOX6可能在多种疾病的发生发展过程中发挥着重要的作用。但SOX6抑制STAT3磷酸化的具体机制仍需进一步的研究。

参考文献：

[1]高钰琪.高原军事医学[M].重庆:重庆出版社,2005.54-74.

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王羽,王授衔,陈德伟,刘宝,高钰琪.SOX6-SOCS3通过STAT3信号通路调控缺氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖[J].第三军医大学学报,2021,43(04):295-302.

基金:十二五军队重大项目(AWS16J023)