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铁死亡探讨乌司他丁对肝缺血-再灌注损伤的保护作用

2024-09-19 55 上传者：管理员

摘要：目的探讨乌司他丁对肝缺血-再灌注损伤的保护作用及机制。方法 24只雄性SD大鼠分成3组，分别为假手术组（Sham组）、肝缺血-再灌注损伤组（HIRI组）、肝缺血-再灌注损伤+乌司他丁预处理组（HIRI+UTI组），每组8只。采用阻断肝门静脉和肝动脉1 h的方法建立大鼠HIRI模型，HIRI+UTI组于造模前30 min腹腔注射乌司他丁，Sham组和HIRI组腹腔注射等量的生理盐水。造模6 h后处死大鼠，收集大鼠血清检测丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平；采用苏木素-伊红（HE）染色法检测肝组织病理学改变；透射电镜观察肝组织线粒体超微结构改变；免疫荧光检测谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)表达；检测肝组织丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、铁、活性氧簇（ROS）及GPX4含量；检测肝组织GPX4、酰基辅酶A合成酶长链家族4(ACSL4)信使RNA(mRNA)和蛋白表达水平。结果与Sham组相比，HIRI组血清ALT、AST水平升高，肝脏出现淤血、肝细胞坏死和肝小叶结构异常等病理改变，病理学评分升高，线粒体缩小，膜密度增加，线粒体嵴断裂甚至消失，ROS、MDA、铁含量升高，GSH含量下降，GPX4荧光强度减弱，ACSL4mRNA及蛋白相对表达量升高，GPX4 mRNA和蛋白相对表达量降低（均为P<0.05）。与HIRI组比较，HIRI+UTI组血清ALT、AST水平降低，肝组织损伤减轻，病理学评分降低，线粒体缩小、嵴断裂情况改善，ROS、MDA、铁含量降低，GSH含量升高，GPX4荧光强度增强，ACSL4 mRNA和蛋白相对表达量降低，GPX4mRNA和蛋白相对表达量升高（均为P<0.05）。结论乌司他丁可减轻大鼠肝缺血-再灌注损伤，其机制可能是通过抑制铁死亡。

关键词：
乌司他丁
缺血-再灌注损伤
肝移植
谷胱甘肽过氧化酶4
酰基辅酶A合成酶长链家族4
铁死亡
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肝脏接受双重血液供应，这使得它更容易受到缺血和缺氧的影响[1]。肝缺血-再灌注损伤是指在长时间缺血缺氧后，由于器官和组织的血供恢复而引起的损伤，是肝切除、肝移植等复杂手术后导致肝功能障碍和肝衰竭的重要危险因素[2-4]。铁死亡是一种由脂质过氧化引起的铁依赖性细胞死亡形式，其特征是活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）产生增加和脂质过氧化[5-6]。乌司他丁是一种存在于尿液中的尿胰蛋白酶抑制剂，已被广泛用于治疗急性胰腺炎、败血性休克、器官衰竭等疾病[7]。近年来，乌司他丁被证明可以通过抑制足细胞ROS聚集来减轻铁死亡，从而缓解脂多糖诱导的急性肾损伤[8]。临床研究中已证实其能够有效减轻心脏、肝脏、肾脏、大脑和肺等器官的缺血-再灌注损伤[9-10]，但乌司他丁在肝缺血-再灌注损伤中的保护机制尚未明确。因此，本研究旨在通过建立大鼠肝缺血-再灌注损伤模型，探讨乌司他丁能否通过抑制铁死亡发挥对肝缺血-再灌注损伤的保护作用。

1、材料与方法

1.1实验材料

1.1.1试剂和器材

乌司他丁购自广东天普生化医药股份有限公司，谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4）抗体购自上海Abmart医药科技有限公司，酰基辅酶A合成酶长链家族4(acylCoA synthetase long-chain family 4,ACSL4）抗体购自上海生工生物工程有限公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，Cy3标记山羊抗兔IgG、ROS探针、谷胱甘肽（glutathione,GSH）试剂盒、电镜固定液购自武汉赛维尔生物科技有限公司，组织铁含量检测试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，丙二醛（malondialdehyde,MDA）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，透射电镜购自日本HITACHI公司，Odessey红外荧光扫膜仪器购自美国Licor公司。

1.1.2实验动物与分组

24只雄性无特定病原体（specefic pathogen free,SPF）级SD大鼠，体质量200～220 g，购于广西医科大学实验动物中心。所有动物饲养于SPF级动物房，在适宜温度下维持12 h昼夜节律，自由进食水。实验经广西医科大学实验动物伦理委员会批准（审批号：202303131）。

按随机数字表法将24只大鼠随机平均分成3组，分别为假手术组（Sham组）、肝缺血-再灌注损伤组（HIRI组）、肝缺血-再灌注损伤组+乌司他丁预处理组（HIRI+UTI组），每组8只。采用异氟烷全麻后，中线切口打开腹腔，用微型腹部扩张器暴露肝脏，然后用无创血管夹夹闭肝左叶和中叶的门静脉及肝动脉，使70%肝脏缺血，观察被夹闭的肝脏颜色变浅表明肝血管阻断成功。1 h后松开血管夹，观察肝脏由白转红表明再灌注成功。假手术组不进行缺血-再灌注处理，仅开腹钝性分离血管。造模前30 min,HIRI+UTI组腹腔注射乌司他丁（100 000 U/kg),Sham组和HIRI组腹腔注射等量的生理盐水。手术结束后6 h处死大鼠，收集血清标本和肝组织进行后续实验。

1.2研究内容与方法

1.2.1肝组织病理学检查

取各组大鼠肝脏，4%多聚甲醛固定24 h后，常规石蜡包埋、切片、苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色，显微镜下观察肝脏病理变化。病理学评分采用Suzuki评分，Suzuki评分含肝窦淤血、肝细胞坏死和细胞质空泡化，每项指标损伤程度由轻到重以0～4计分。

1.2.2肝功能检测

取大鼠下腔静脉血，4℃2 700×g离心15 min后收集上清。根据ALT和AST测定试剂盒说明书进行操作，采用全自动分析仪，计算各样本ALT、AST水平。

1.2.3肝组织MDA、GSH、铁含量检测

将大鼠肝组织称重后，加入9倍体积预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline,PBS）机械匀浆，制备成10%的匀浆液，3 150×g离心10 min后取上清液待测。按照试剂盒说明书检测肝组织中MDA、GSH、铁含量。

1.2.4肝组织ROS水平检测

取各组大鼠肝脏冰冻切片，复温后加入自发荧光淬灭剂，然后将切片和ROS染液在37℃下避光孵育30 min。使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）复染细胞核后在荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.5透射电镜观察线粒体超微结构

各组大鼠取材后，迅速将肝脏切成1 mm3大小，然后立即置于4℃电镜固定液内避光固定2～4 h，缓冲液冲洗后投入1%锇酸固定液中室温固定1～3 h，经漂洗、室温脱水、渗透包埋、切片后用醋酸铀、柠檬酸铅对切片进行双染，在透射电镜下观察线粒体结构，并采集图像分析。

1.2.6聚合酶链反应检测肝组织GPX4、ACSL4的信使RNA表达

取大鼠肝脏组织，用Trizol试剂提取总RNA并逆转录为互补DNA，后进行扩增。计算GPX4、ACSL4信使RNA(messenger RNA,m RNA）的相对表达量。引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成，引物序列见表1。

表1本实验所用基因的引物序列

Table 1 Primer sequences of genes in the experiment

1.2.7免疫荧光检测肝组织GPX4表达

取肝组织石蜡切片，经脱蜡至水、抗原修复及封闭后，加入GPX4抗体（1∶200)4℃孵育过夜，次日加Cy3标记山羊抗兔IgG室温孵育1 h。使用DAPI复染细胞核，抗荧光淬灭封片剂封片后采用荧光显微镜观察并采集图像。

1.2.8蛋白质印迹法检测蛋白表达

新鲜肝组织中加入蛋白裂解液提取总蛋白，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度，电泳转膜后，使用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，洗膜后GPX4、ACSL4、GAPDH一抗4℃孵育过夜。次日洗涤后加入二抗室温摇床孵育2 h。使用Odessey红外荧光扫描仪扫描膜并显影，Image J软件分析图像。

1.3统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组大鼠肝组织病理学改变比较

Sham组肝组织结构完整，肝细胞排列致密、整齐，肝窦呈放射状；HIRI组肝小叶结构改变，肝细胞变形、坏死，门管区大量炎症细胞浸润，肝血窦受压严重变窄；HIRI+UTI组肝脏充血肿胀，肝细胞坏死数量减少，周围炎症细胞浸润等病理改变较HIRI组减轻。Suzuki评分显示，HIRI组评分高于Sham组，HIRI+UTI组评分低于HIRI组，差异均有统计学意义（均为P<0.05，图1）。

2.2各组大鼠肝功能比较

与Sham组比较，HIRI组ALT和AST水平升高；与HIRI组比较，HIRI+UTI组ALT和AST水平降低（均为P<0.05，图2）。

2.3各组大鼠肝细胞线粒体超微结构变化

透射电镜下，Sham组线粒体形态规则，多呈圆形或椭圆形，线粒体膜外形完整，细胞核膜清晰；HIRI组线粒体萎缩，膜密度增加，线粒体嵴断裂甚至消失；HIRI+UTI组线粒体形态变化较HIRI组明显改善（图3）。

2.4各组大鼠肝组织MDA、GSH、铁含量比较

与Sham组比较，HIRI组MDA、铁含量升高，GSH含量降低；与HIRI组比较，HIRI+UTI组MDA、铁含量降低，GSH含量升高（均为P<0.05，图4）。

2.5各组大鼠肝组织ROS表达比较

与Sham组比较，HIRI组ROS水平升高；与HIRI组比较，HIRI+UTI组ROS水平降低（均为P<0.05，图5）。

图1各组大鼠肝组织病理学改变及评分比较

2.6各组大鼠肝组织中GPX4、ACSL4 mRNA表达水平比较

与Sham组比较，HIRI组GPX4 mRNA相对表达量降低，ACSL4 mRNA相对表达量升高；与HIRI组比较，HIRI+UTI组GPX4 mRNA相对表达量升高，ACSL4 mRNA相对表达量降低（均为P<0.05，图6）。

2.7各组大鼠肝组织GPX4免疫荧光结果

与Sham组比较，HIRI组GPX4蛋白表达减少；与HIRI组比较，HIRI+UTI组GPX4蛋白表达增多（均为P<0.05，图7）。

2.8各组大鼠肝组织GPX4、ACSL4蛋白表达水平比较

与Sham组比较，HIRI组GPX4蛋白相对表达量下降，ACSL4蛋白相对表达量升高；与HIRI组比较，HIRI+UTI组GPX4蛋白相对表达量升高，ACSL4蛋白相对表达量下降（均为P<0.05，图8）。

3、讨论

肝缺血-再灌注损伤是肝供血中断引起并在再灌注后加重的病理状态，是肝移植等肝脏手术中最致命的危险之一[11]。缺血-再灌注损伤的过程涉及一系列事件，炎症和过量的ROS是导致细胞凋亡、组织损伤和器官功能障碍的最关键因素[12-13]。再灌注损伤主要来源于O2重新进入缺血组织后产生的毒性ROS，这些ROS直接影响组织损伤，并引发一系列有害的细胞反应，导致炎症、细胞死亡和器官衰竭[14-17]。本研究结果显示，HIRI组大鼠血清ALT、AST水平升高，病理学染色结果显示肝组织出现大范围缺血灶，肝细胞发生肿胀、变形及坏死，提示阻断肝动脉和门静脉后成功引起了肝缺血-再灌注损伤。且大鼠肝组织ROS水平显著升高，与之前的研究结果一致[18-20]。

图2各组大鼠血清ALT和AST的比较

图3各组大鼠线粒体超微结构变化(×8 000)

图4各组大鼠肝组织MDA、GSH和铁含量的比较

图5各组大鼠肝组织ROS的表达情况

图6各组大鼠肝组织GPX4、ACSL4 mRNA表达水平的比较

铁死亡是一种细胞死亡形式，当铁代谢紊乱引起细胞内游离铁增多时，催化产生大量ROS,ROS进一步促进脂质过氧化，引起脂质过氧化物集聚，破坏细胞内氧化还原平衡，最终使细胞发生死亡[21]。铁死亡发生机制复杂，线粒体缩小、嵴断裂或消失是铁死亡的典型形态学改变[22-23]。铁超载驱动的芬顿反应被认为是发生铁死亡的必要条件[5]。MDA被认为是脂质过氧化的标志[24]。GSH是细胞内重要的抗氧化剂，也是GPX4重要的辅助因子，GSH被GPX4利用以减轻脂质过氧化的发生，从而抑制铁死亡的发生[25-27]。GPX4可以将细胞毒性脂质过氧化物转化为脂质醇，减少ROS的产生，被认为是铁死亡的重要调控因子[28-30]。ACSL4通过促进磷脂过氧化导致铁死亡的发生，是铁死亡激活的标志[31-33]。铁死亡与癌症、神经变性疾病和缺血-再灌注组织损伤密切相关[34-37]。本研究中，阻断肝动脉和门静脉后，肝脏的线粒体出现萎缩，嵴断裂甚至消失，伴随ROS、MDA和铁含量升高，GSH含量降低，GPX4蛋白表达减少，ACSL4蛋白表达增多，表明铁死亡在缺血-再灌注后肝脏损伤的机制中可能发挥着重要作用。

乌司他丁是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，目前广泛应用于临床[38-41]。研究表明乌司他丁可通过抑制机体内氧自由基的产生、激活肝细胞自噬、抑制细胞因子的产生和释放、抑制水解酶、稳定溶酶体膜、减轻肝脏组织过氧化反应，从而减轻由缺血-再灌注造成的肝脏损伤[42-44]。本研究中，HIRI+UTI组大鼠较HIRI组血清ALT、AST水平降低，肝组织坏死减少，表明乌司他丁对肝缺血-再灌注损伤具有保护作用，与之前的研究结果一致[45-46]。且HIRI+UTI组大鼠肝组织中ROS水平、MDA和铁含量下降，GSH含量增加，GPX4蛋白表达增多，ACSL4蛋白表达减少，表明乌司他丁是通过抑制铁死亡减轻了肝缺血-再灌注损伤。

综上所述，乌司他丁可通过减轻铁死亡，对肝缺血-再灌注损伤发挥保护作用，这可能成为未来治疗肝缺血-再灌注损伤的新靶点。

图7各组大鼠肝组织GPX4表达情况

图8各组大鼠肝组织GPX4、ACSL4蛋白表达水平比较

参考文献:

[1]王宇,王民,张冠华,等.循环系统疾病的肝脏表现[J].中华肝脏病杂志, 2022, 30(4):362-366.

[3]曾侯帅,王运兵,陈刘璇子,等. Maresin 1抑制核因子κB/胱天蛋白酶-3/焦孔素E信号途径减轻肝脏缺血再灌注损伤[J].中华肝脏病杂志, 2023, 31(6):594-600.

基金资助:广西自然科学基金(2018GXNSFAA281101);

文章来源:陈实,赵漾,周尧,等.基于铁死亡探讨乌司他丁对肝缺血-再灌注损伤的保护作用[J].器官移植,2024,15(05):780-788.