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体外药物性肝损伤模型中miR-122的作用及相关研究

2024-11-22 34 上传者：管理员

摘要：目的研究体外药物性肝损伤肝细胞模型miR-122干预后肝损伤指标、肝细胞增殖以及IL-6水平的变化，探索miR-122在药物性肝损伤肝细胞的可能作用及机制。方法将肝细胞分为Ctrl组、APAP组、APAP+mimic-NC组、APAP+miR-122 mimic组、APAP+inhibitor-NC组、APAP+miR-122 inhibitor组6组，分别取各组细胞上清液，通过PCR法、免疫组化法等分别检测miR-122、AST、ALT、IL-6表达水平及细胞增殖水平。结果 (1)miR-122水平比较：APAP+miR-122 mimic组miR-122表达水平最高，APAP+miR-122 inhibitor组miR-122表达水平最低，提示细胞转染成功，APAP组miR-122表达水平与APAP+mimic-NC组、APAP+inhibitor-NC组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。(2)细胞增殖水平比较：Ctrl组细胞增殖水平最高，APAP+miR-122 inhibitor组细胞增殖水平最低，APAP组与APAP+mimic-NC组、APAP+inhibitor-NC组细胞增殖水平差异无统计学意义(P>0.05),与APAP+miR-122 mimic组细胞增殖水平差异有统计学意义(P<0.05)。(3)肝损伤指标比较：Ctrl组AST、ALT水平最低；APAP+miR-122 inhibitor组AST、ALT水平最高；APAP组与Ctrl组、APAP+miR-122 mimic组、APAP+miR-122 inhibitor组AST、ALT水平之间差异有统计学意义(P<0.05);与APAP+mimic-NC组、APAP+inhibitor-NC组AST、ALT水平之间差异无统计学意义(P>0.05)。(4)IL-6表达水平比较IHC结果显示：Ctrl组IL-6表达水平最低，APAP+miR-122 inhibitor组IL-6表达水平最高；APAP组与APAP+miR-122 mimic组、APAP+miR-122 inhibitor组之间IL-6表达水平差异有统计学意义(P<0.05),与APAP+mimic-NC组、APAP+inhibitor-NC组之间IL-6表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 miR-122可能通过调控IL-6实现对DILI肝细胞的保护作用。

关键词：
DILI发病率
IL-6
miR-122
代谢产物
肝细胞损伤
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药物性肝损伤(drug-induced liver injury, DILI)是指药物本身或其代谢产物引起的肝损伤，是导致已获批药物退出市场或阻碍临床潜在药物开发的主要原因[1]。我国DILI发病率达到23.8/10万人[2]。miR-122是肝脏特异性多功能微小RNA[3],参与肝细胞表型、脂质和胆固醇生物合成、胆红素和铁代谢、氧化应激反应等[4]。已有研究证明，miR-122是DILI的潜在生物标志物，正在进行各种临床试验[5]。当DILI发生时，肝脏产生许多炎症因子[6]。当对乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)过量时，肝脏不仅产生IL-4、IL-10等抗炎因子，还产生IL-6、TNF-α等促炎因子[7-12]。我们前期实验发现APAP模型大鼠体内血液中miR-122和IL-6水平均升高[13]。给予急性药物性肝损伤(acute drug-induced liver injury, ADILI)模型大鼠miR-122激动剂干预后，血液IL-6水平较干预前升高，推测miR-122有可能通过调控IL-6参与DILI的炎症过程。本研究通过制备体外APAP肝细胞模型和miR-122转染细胞模型，通过荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)等实验方法检测肝损伤指标、细胞增殖水平、miR-122和IL-6水平变化，分析不同分组细胞各研究指标之间差异性，以期进一步探索miR-122在DILI肝细胞中可能发挥的作用及机制。

1、材料与方法

1.1细胞、主要试剂与仪器

人肝细胞(HepaRG)购自广州吉妮欧生物科技有限公司；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(C0009)购自Beyotime公司；PCR试剂盒(RR047A)购自Takaya公司；AST测试盒(C010-3)和ALT试剂盒(C009-3)均购自南京建成公司；抗IL-6抗体(ab9324)购自Abcam公司；血生化仪购自日本日立公司；PCR仪购自Applied Biosystems公司。

1.2细胞培养与转染

取HepaRG细胞，经过培养、转染miRNA mimic或mimic-NC、APAP药物诱导肝损伤细胞后，将肝细胞分为Ctrl组、APAP组、APAP+mimic-NC组、APAP+miR-122 mimic组、APAP+inhibitor-NC组、APAP+miR-122 inhibitor组6组，更换完全培养基继续培养24 h后，取细胞上清液进行研究指标检测。

1.3研究指标检测

采用PCR法检测肝细胞上清液miR-122水平，记录2-△△ct值；应用全自动生化分析仪检测肝细胞上清液AST、ALT水平；采用MTT检测细胞增殖活性，记录MTT值；采用免疫组化法(immunohistochemistry, IHC)检测细胞IL-6水平，记录IOD值。

1.4统计学分析

应用GraphPad Prism 8.3对数据进行分析和绘图。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1不同分组细胞miR-122水平比较

APAP组相较于ctrl组miR-122表达水平显著降低；APAP+mimic-NC组、APAP+inhibitor-NC组、APAP组miR-122表达水平相当；APAP+miR-122 mimic组miR-122表达水平显著高于APAP组；而APAP+miR-122 inhibitor组相较于APAP组miR-122表达水平下降，提示转染成功(见图1、表1)。

图1不同分组miR-122比较

2.2不同分组细胞增殖水平比较

Ctrl组细胞增殖水平最高，APAP组细胞增殖水平低于Ctrl组，提示APAP组细胞增殖能力降低，DILI细胞模型制备成功；APAP组与APAP+mimic-NC组、APAP+inhibitor-NC组细胞增殖水平比较，差异无统计学意义(P>0.05);APAP+miR-122 mimic组细胞增殖水平较APAP组升高，APAP+miR-122 inhibitor组细胞增殖水平较APAP组降低(P<0.05,见图2、表1),提示miR-122可能会促进细胞增殖。

图2不同分组细胞增殖比较

2.3不同分组肝损伤指标比较

APAP组相较于Ctrl组AST、ALT明显增加，差异有统计学意义，提示APAP组细胞存在损伤，DILI细胞模型制备成功；APAP组与APAP+mimic-NC组、APAP+inhibitor-NC组AST、ALT水平比较差异无统计学意义（P>0.05);APAP组AST、ALT水平高于APAP+miR-122 mimic组，低于APAP+miR-122 inhibitor组，三组AST、ALT水平之间差异有统计学意义（P<0.05），提示miR-122对肝细胞损伤有一定的保护作用（见图3、表1）。

图3不同分组AST、ALT比较

2.4不同分组细胞IL-6水平比较

Ctrl组IL-6表达水平最低，APAP组较Ctrl组表达水平增高，APAP+miR-122 inhibitor组IL-6表达水平最高；APAP组与APAP+mimic-NC组、APAP+inhibitor-NC组之间IL-6表达水平差异无统计学意义(P>0.05);APAP组IL-6表达水平较APAP+miR-122 mimic组高，较APAP+miR-122 inhibitor组低，差异有统计学意义(P<0.05),提示肝细胞损伤后，miR-122与IL-6变化水平相反，推测miR-122可能通过抑制IL-6水平而保护肝细胞损伤(见图4～5、表1)。

图4不同分组IL-6表达水平(放大200倍);图5不同分组IL-6水平比较

表1不同分组研究指标检测值

3、讨论

报道显示导致DILI的临床药物在动物实验中有38%检测不到[14],这是因为物种差异性使得动物与人类的药物代谢并不完全一致，所以动物模型研究结果并不能完全代表人类[15]。基于此我们设计了体外实验，将人HepaRG细胞进行传代培养，用APAP药物诱导和细胞转染技术制备成各种细胞模型Ctrl、APAP、APAP+mimic-NC、APAP+miR-122 mimic、APAP+inhibitor-NC、APAP+miR-122 inhibitor,研究体外ADILI细胞模型中miR-122和IL-6的表达水平并探索miR-122和IL-6可能存在的关系。

肝损伤指标研究显示APAP+miR-122 mimic组较APAP组AST、ALT水平明显下降；而APAP+miR-122 inhibitor组相较于APAP组AST、ALT水平明显升高，提示miR-122对肝损伤有一定的保护作用。这种保护作用可能因为miR-122与肝脏再生相关，肝脏修复和再生对于急性肝损伤的结局至关重要。药物在诱导启动肝组织损伤的同时也可激发肝组织自身修复过程，虽然大多数DILI呈急性病程，但如果肝组织恢复性修复可以早期有效地限制逆转肝损伤，便可以避免急性肝衰竭和肝损伤慢性病程化的发生，缩短肝损伤的临床病程，改善不良转归，使患者受益。已有证据[16]显示，一定情况下miR-122水平变化可反映DILI后肝脏再生。在异烟肼制备的大鼠抗结核DILI模型中，miR-122水平3 d时显著降低，14 d时降到最低点，然后上升，同时ALT、AST在给药后21 d和14 d分别达到最高值，然后有所下降，他们分析miR-122的水平上升与肝脏再生密切相关[17]。崔立华等制备的丙戊酸钠DILI模型，同样发现实验组miR-122在给药7 d后逐渐向正常水平回升，结合ALT、AST变化水平与肝脏病理结果，认为miR-122水平回升可能与肝细胞再生和自身修复有关[18]。此外，危及生命的急性肝功能衰竭(acute liver failure, ALF)大多数需要肝移植来防止死亡，但一些患者会自发恢复，并显示出完全的肝脏再生[19]。John等[20]通过研究ALF患者血清miRNAs与肝损伤和再生的相关性，发现与未恢复患者相比，ALF自愈的患者血清miR-122、miR-21和miR-221水平显著升高。而在肝活检组织中，miR-21和miR-221呈双向表达模式，在自发存活者中水平较低，miR-122则在这些患者的血清和肝组织中均升高。提示miR-122、miR-21和miR-221均参与了肝再生，并可能有助于ALF的自发恢复[16]。目前，关于miR-122与肝脏再生相关的研究极少，DILI的肝损伤过程和肝恢复性修复过程中miR-122的动态变化及机制尚不明确。IL-6在miR-122 mimic后表达水平降低，而在miR-122 inhibitor后表达水平增加，提示IL-6可能是miR-122的直接靶标。

在我们的体外实验中通过IHC研究发现药物性肝损伤后IL-6水平升高，其水平与健康对照组差异有统计学意义，并且APAP+miR-122 mimic组相较APAP组IL-6表达水平降低，APAP+miR-122 inhibitor组相较于APAP组IL-6表达水平升高。推测DILI后miR-122与IL-6变化水平相反，miR-122可能通过抑制IL-6而保护肝细胞损伤。这与Hsu及Sendi等[21-22]的研究结果一致，他们发现miR-122缺陷小鼠和miR-122缺陷的肝类器官中，IL-6和TNF-α水平均升高。既往报道急性肝损伤期间IL-6升高启动肝细胞的再生反应，肝细胞增殖反映为IL-6水平升高[23],而我们的研究结果似乎表明，IL-6水平越低越好。事实上，关于肝损伤后肝再生过程中IL-6表达水平具体如何动态变化，以及与肝再生程度及再生时间点的对应关系尚不明确。研究显示IL-16可以很好地促进肝硬化大部分切除术后肝组织再生[24]。Bajt等发现APAP过量后注射重组IL-6不能促进再生，许多能促进再生的治疗也不能增加IL-6表达[25]。所以在肝脏再生过程中，似乎IL-6的表达水平也不是越高越好。出现这种情况可能原因如下：(1)IL-6表达水平可能是动态变化的，并不是一直呈上升或下降趋势；(2)IL-6作为一种细胞因子半衰期很短，可能存在可逆性变化；(3)或许IL-6表达水平有一个峰值，低于峰值而高于基础值促进再生，高于峰值后即使增加IL-6浓度也不起作用；(4)研究选择的时间点不同，得出的IL-6表达水平不同；(5)在疾病的不同阶段和背景下，IL-6是一种双重作用因子，在肝脏损伤早期它们作为促炎介质，在肝脏损伤后期则作为抗炎介质促进组织损伤修复及肝细胞的再生。

既往也曾报道IL-6对急性肝损伤有保护作用。IL-6敲除小鼠肝脏再生受损，同样在胆汁淤积条件下，如果IL-6信号减弱，再生肝祖细胞的数量也会减少[26]。研究显示在梗阻性黄疸肝组织中发现IL-6表达增加，并参与梗阻性黄疸早期肝损伤的炎性反应及肝损伤后组织恢复性修复[27]。IL-6除了作为肝损伤和炎症的标志物，也通过调节肝巨噬细胞的炎症反应来改善脂多糖/D-半乳糖胺诱导的急性肝损伤[28]。IL-6从肝脏产生并作用于肝脏，是急性期反应的一个决定因素[29],随着研究的深入，发现急性肝损伤期间产生的IL-6刺激产生的急性期蛋白质也有助于恢复肝功能[30]。IL-6在炎症和损伤的急性期，通过促进细胞增殖、血管生成和代谢、下调细胞凋亡和氧化应激来保护肝脏。有趣的是Li等报道IL-6可以保护APAP引起的小鼠急性肝损伤[31],而且在DILI患者中有新的发现，即IL-2/IL-6与药物治疗后患者肝功能指标ALT、AST呈显著的线性负相关，与随访1个月时的ALT、AST呈正相关，他们认为IL-2/IL-6可能是肝损伤预后的一个新的预测指标，可作为急性肝损伤预后的临床指标[32]。

本研究表明miR-122有可能通过干预IL-6实现DILI中对肝细胞的保护作用，未来需要更多的研究选择更多的时间点来进一步探索及验证肝损伤后肝再生过程中miR-122与IL-6表达水平具体如何动态变化，以及miR-122与IL-6的关系。它们或许是研究肝损伤及肝再生的桥梁，也可能是急性肝损伤的潜在治疗靶点，也期望在临床工作中通过对急性肝损伤或肝脏围手术期患者IL-6的监测，结合肝功能指标，能够早期判断肝脏损伤或预测治疗效果。

参考文献:

[13]古巧燕,王会丰,李敏.急性药物性肝损伤血清miR-122与肝损伤指标相关性研究[J].胃肠病学和肝病学杂志,2019,28(3):330-334.

[17]李玉红,朱凌妍,田慎谦,等.miRNA-122在异烟肼肝损伤大鼠中的调控机制[J].中国医院药学杂志,2016,36 (2):97-102.DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2016.02.05.

[18]崔立华,李扬,白晶,等.血清miR-122和miR-155在丙戊酸钠诱导小鼠仔鼠肝损伤中的表达[J].天津医药,2021,49(6):593-597.DOI:10.11958/20202948.

基金资助:2020年度陕西省留学人员科技活动择优资助项目(2020014);陕西省重点研发计划一般项目—社会发展领域(2017SF-157);

文章来源:李娟娟,艾克鹏,杨佳,等.体外药物性肝损伤模型中miR-122的作用及相关研究[J].胃肠病学和肝病学杂志,2024,33(11):1482-1486.