首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 肝脏疾病论文 > 杨梅素通过调控NF-κB和炎症因子对肝脏缺血再灌注损伤的作用研究

杨梅素通过调控NF-κB和炎症因子对肝脏缺血再灌注损伤的作用研究

2024-11-30 54 上传者：管理员

摘要：目的观察杨梅素(Myr)对肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)炎性因子的作用。方法将C57BL/6小鼠分为4组，手术组(Sham)、缺血再灌注组(HIRI)、低剂量杨梅素组(HIRI-Myr-L)和高剂量杨梅素组(HIRI-Myr-H),建立肝脏缺血再灌注损伤模型。测定谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST);HE染色检测各组小鼠肝组织形态情况；Western blot和qRT-PCR检测各组肝组织中核转录因子-κB(NF-κB)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)的蛋白及mRNA表达情况。结果与HIRI组比较，HIRI-Myr-L、HIRI-Myr-H组ALT、AST水平均明显下降(P均<0.05);肝脏缺血面积明显减少，肝细胞肿胀变形减少；NF-κB、IL-6、TNF-α、IL-1β蛋白及mRNA表达水平降低(P均<0.05)。结论杨梅素能够抑制小鼠肝脏缺血再灌注诱导的NF-κB以及IL-6、TNF-α、IL-1β等炎症因子的表达升高，缓解肝脏损伤。

关键词：
杨梅素
核转录因子-κB
炎症因子
缺血再灌注损伤
肝脏
加入收藏

肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)是肝脏切除手术或肝移植等外科手术后急性肝衰竭或死亡的主要原因，严重影响患者的预后[1]。HIRI病理过程主要包括缺血损伤期和再灌注损伤期两个阶段。在缺血损伤期，缺血导致的糖原消耗、供氧不足和腺嘌呤核苷三磷酸耗竭引起局部肝细胞水肿变性乃至坏死。再灌注损伤期，肝脏血供恢复，继发代谢紊乱及炎症信号通路激活，促使肝脏多种免疫细胞浸润，进一步加重肝脏损伤[2-3]。研究表明炎症因子表达和炎症细胞浸润是HIRI发生的重要机制[4]。NF-κB作为调节机体炎症反应的关键性转录启动因子，可以调控TNF-α、IL-6、IL-1β等下游炎症因子的分泌[5]。研究发现缺血再灌注后1h即可发现肝细胞核内NF-κB表达明显升高，且2h后TNF-α的表达也增高，这说明在HIRI过程中NF-κB信号被激活，并影响细胞因子等炎症介质的表达[6-7]。Matsui等[8]也证明NF-κB活化参与HIRI过程，并指出抑制NF-κB表达可显著改善HIRI。因此，靶向调控NF-κB的表达，缓解炎症反应可能是改善HIRI临床治疗的关键。

杨梅素是一种常见的黄酮类化合物，具有多种药理作用，如消炎、抗氧化、镇痛、抗肿瘤、降血糖、保护肝脏等[9-10]。研究[11]发现，杨梅素通过调节PPARγ/NF-κB途径发挥抗心肌缺血再灌注损伤。此外研究[12]表明，杨梅素还能抑制Akt、mTOR及NF-κB信号通路，减轻TNF-α介导的炎症因子的产生。在小鼠急性肝损伤中，杨梅素可降低ALT和AST水平，减少肝脏细胞变性及程序性坏死[13]。但有关杨梅素在HIRI中的作用尚未见报道。本研究通过建立小鼠HIRI模型，探讨杨梅素的保护作用。

1、材料与方法

1.1实验动物

于斯贝福(北京)生物技术有限公司购入C57BL/6雄性小鼠，并喂养于SPF级动物房中，适应性喂养7d,在光照12h,黑暗12h,湿度45%～55%,温度(25±1)℃的条件下，自由进食和水。

1.2主要试剂与仪器

杨梅素(PS001011)购置Push Bio-technology公司；NF-κB抗体(GB11997)、IL-6抗体(GB11117)、TNF-α抗体(GB11188)、GAPDH抗体(GB15004)、一抗稀释液(G2025)、二抗稀释液(G2009)试剂、TRIzol(G3013)、HE染液套装购自Servicebio公司；IL-1β抗体(A16288)购自ABclonal公司；丙氨酸转氨酶(ALT)(C009)、天冬氨酸转氨酶(AST)(C010)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；ToloScript All-in-one RT EasyMix for qPCR(22107)、2xQBR qPCR Master Mix(Universal)(22204)购自TOLO-BI0公司；荧光定量PCR仪、凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司);NanoDrop2000(中国赛默飞世尔科技有限公司);高速冷冻离心机(德国Eppendorf股份有限公司);正置显微镜(日本Olympus科技有限公司);全自动酶标仪(中国赛默飞世尔科技有限公司);组织研磨仪(Servicebio公司)。

1.3方法

1.3.1动物模型的制备及处理

24只雄性C57BL/6小鼠随机分为4组：手术组(Sham组)、缺血再灌注组(HIRI组)、低剂量杨梅素组(HIRI-Myr-L组)、高剂量杨梅素组(HIRI-Myr-H组),每组6只。HIRI-Myr-L组和HIRI-Myr-H组小鼠在造模前7d分别连续灌胃杨梅素50、100mg/kg, Sham组及HIRI组小鼠灌胃等体积含5%二甲基亚砜的溶剂。构建小鼠肝脏缺血再灌注模型，按照50g/kg的剂量1%戊巴比妥采用腹腔注射给小鼠进行麻醉，麻醉后仰卧固定。剪开小鼠腹腔，避免损伤剑突，采用无创血管夹夹闭肝动脉及门静脉，使小鼠肝左半叶和肝中叶处于缺血状态。血流阻断45min后，取出无创血管夹，恢复缺血肝血流。缝合小鼠腹部切口，再灌注16h。Sham组小鼠在开腹后仅补充生理盐水而无其他任何处理，同样等待45min后关闭腹腔。

1.3.2样本采集与检测

于再灌注16h后麻醉小鼠，剪去小鼠胡须，并用眼科镊取小鼠眼球血，血样离心(3000rpm, 10min)得到血清。采用颈椎脱臼法依次处死各组小鼠，小心分离各肝叶，取下缺血叶肝脏组织，并取一小份用4%多聚甲醛溶液固定，其余肝脏组织标本与血清一同储存于-80℃冰箱中以备用。

1.3.3血清ALT、AST水平测定

从-80°C冰箱取出小鼠血清样本置于冰上溶解。将各组血清样本按照浓度梯度用PBS稀释好，并按照ALT、AST检测试剂盒说明在96孔板中加入相应试剂以及样本。使用酶标仪在37℃、510nm处测定各孔吸光度。按照公式分别计算出各组血清的ALT、AST值。

1.3.4肝组织缺血形态学

采用HE染色法，取每组小鼠肝脏组织石蜡切片，然后经脱蜡、苏木素染色、伊红染色、脱水、中性树脂封片，在显微镜下观察并拍片。

1.3.5 Western blot检测

取各组小鼠肝组织10mg加入300μL组织裂解液，研磨珠配平后于超速破碎仪充分研磨，所得组织匀浆液置冰上裂解30min, 4℃,12 000rpm离心10min后，取上清液测BCA进行蛋白定量，加入5×loadingbuffer充分混匀，于98℃煮沸10min进行蛋白变性，10%SDS-PAGE电泳，200mA转膜90min, 5%脱脂牛奶封闭90min, 4℃摇床过夜孵育一抗稀释液NF-κB(1∶1000)、TNF-α(1∶1000)、IL-6(1∶1000)、IL-1β(1∶1000)和GAPDH(1∶1000)。第2天，用1×TBST洗膜3次，5min/次，放入配制好的二抗溶液中室温孵育90min(1∶5000),再用1×TBST洗膜3次，5min/次，配制ECL发光显影液进行显影。使用ImageJ软件对各蛋白条带灰度值进行分析。

1.3.6实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)

取-80℃冰箱保存的小鼠肝组织，以TRIzol试剂提取组织的总RNA,NanoDrop 2000测定RNA总浓度，反转录为cDNA,进行实时荧光定量PCR,条件：95℃2min, 95℃10s, 60℃15s, 72℃30s,总共44个循环。以36B4为内参定量NF-κB、IL-6、TNF-α、IL-1β表达，采用2-△△Ct计算相对表达量。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4统计学方法

GraphPadPrism 8.0.1(244)软件分析数据数据形式均以表示，多组数据的比较采用one-wayANOVA检验，两组数据之间采用t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1杨梅素预处理可降低HIRI小鼠ALT、AST水平

如图1结果显示，Sham组小鼠中血清ALT、AST活性很低，而HIRI组小鼠中血清ALT、AST活性明显升高(P<0.001),这说明缺血再灌注损伤模型构建成功。此外，与HIRI组相比，HIRI-Myr-H、HIRI-Myr-L组的血清ALT和AST水平均显著降低，具有统计学差异(P均<0.001)。以上结果表明，杨梅素可以减轻HIRI引起的肝功能损伤。

图1杨梅素预处理HIRI小鼠血清ALT、AST水平情况

2.2杨梅素预处理能减轻小鼠HIRI引起的肝脏组织病理损伤

图2结果表明，在Sham组中可以观察到小鼠肝小叶结构清晰规则以及形态正常的肝实质细胞，无明显病理学改变；HIRI组小鼠肝组织出现静脉扩张充血，肝小叶结构明显破坏，表现为不同程度肝小叶紊乱、肝细胞肿胀或大片坏死、大量炎性细胞浸润以及局部肝窦充血，HIRI-Myr-H组和HIRI-Myr-L组小鼠肝小叶结构可辨，肝脏坏死区域明显减少，且局部肝窦充血情况有所改善。HIRI组小鼠肝组织坏死面积显著大于Sham组，HIRI-Myr-H组和HIRI-Myr-L组小鼠肝组织坏死面积显著小于HIRI组。以上结果表明，杨梅素可以减轻HIRI引起的组织病理损伤。

图2杨梅素预处理能减轻小鼠HIRI引起的组织病理损伤(标尺：50μm)

2.3杨梅素能够抑制HIRI诱导的肝脏炎症因子蛋白的表达

图3实验结果显示，HIRI组小鼠肝脏组织中的IL-1β、TNF-α、IL-6水平与Sham组相比均上调(P均<0.001)。而与HIRI组相比，HIRI-Myr-H、HIRI-Myr-L组小鼠肝脏组织中的IL-1β、TNF-α、IL-6炎症因子蛋白表达水平下降，具有统计学差异(P均<0.05)。结果表明HIRI导致肝脏组织经历无菌性炎症，杨梅素可减少HIRI过程中IL-1β、TNF-α、IL-6等炎症因子的产生，减轻HIRI诱导的炎症反应。

图3 Western blot杨梅素对肝脏缺血再灌注损伤炎症因子表达情况

2.4杨梅素能够抑制HIRI诱导的肝脏炎症因子mRNA的表达

HIRI小鼠肝组织中IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA相对表达量与Sham组相比显著上调，HIRI-Myr-H、HIRI-Myr-L组小鼠肝组织中炎症因子mRNA相对表达量显著低于HIRI组，差异均有统计学意义(P均<0.05),见图4。以上结果表明杨梅素预处理能够抑制小鼠HIRI引起的炎症因子mRNA的表达。

图4 qRT-PCR法检测小鼠肝组织中炎症因子mRNA的表达情况

2.5杨梅素抑制NF-κB信号通路缓解肝脏缺血再灌注损伤

小鼠肝脏在缺血再灌注损伤后，肝脏组织NF-κB表达升高(P<0.001)。同时，HIRI-Myr-H、HIRI-Myr-L组与HIRI组相比，小鼠在肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中NF-κB表达被显著抑制，差异均有统计学意义(P<0.01),见图5。

图5杨梅素预处理小鼠肝脏缺血再灌注后肝组织中NF-κB表达情况

3、讨论

ALT和AST是肝功能检查的两项常用指标，当肝脏受损时，可引起ALT和AST水平升高[14]。本研究结果表明HIRI组血清肝酶显著增加，杨梅素预处理可显著降低小鼠ALT和AST的血清水平。此外。肝脏组织形态学检查发现，HIRI-Myr-H、HIRI-Myr-L组较HIRI组肝小叶结构可辨，肝脏坏死区域明显减少，肝细胞水肿、炎性浸润明显减少，且局部肝窦充血情况有所改善。以上提示杨梅素能够减轻小鼠缺血再灌注诱导的肝组织结构损伤。

由于目前还没有完全了解HIRI机制，其发病机制及防治措施已经成为研究热点。该损伤的过程可能与再灌注后的炎症反应、氧自由基生成、线粒体损伤、细胞凋亡、Ca2+超载和白细胞的活化等有关，而炎症介质大量释放是导致HIRI病理过程中最主要的介导因素之一[15]。

NF-κB可调控炎性因子的转录与表达。在缺血再灌注损伤中，NF-κB作为炎症损伤反应启动因素之一，可调节多种参与缺血再灌注损伤的细胞因子、黏附分子的基因转录过程，并控制它们生物合成，而导致缺血再灌注损伤发生[16]。Yang等[17]发现在小鼠肝脏部分切除后，在肝巨嗜细胞内NF-κB被激活。Zwacka等[18]发现缺血再灌注时肝组织NF-κB被激活并影响炎症因子表达。本实验研究结果也同样发现，在肝脏缺血再灌注中，NF-κB表达升高，炎症因子表达增多，损伤加剧。在HIRI中，受损的肝细胞和肝窦内皮细胞在释放多种损伤相关模式分子的同时，产生大量的ROS,导致多细胞免疫反应的启动[19],库普细胞能识别结合这些分子，激活的NF-kB能上调多种炎症细胞因子基因转录(如TNF-α、IL-6、IL-1β),而这些细胞因子产生后会继续激活NF-κB,增强炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β等的不断释放，形成NF-κB信号转导通路正反馈调控机制[20]。因此，HIRI中TNF-α、IL-6、IL-1β水平直接反映缺血再灌注肝脏炎症性损伤的程度。本研究结果表明，与Sham组相比，HIRI组小鼠肝脏组织中的NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平上调。此外，我们也明确了杨梅素减轻HIRI的炎症性损伤作用，与HIRI组相比，HIRI-Myr-H、HIRI-Myr-L组小鼠肝脏组织中的NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平下降。

综上所述，杨梅素可以缓解肝脏缺血再灌注损伤，抑制NF-κB和炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的表达，对于缺血再灌注损伤的肝脏具有保护作用，其潜在机制可能与抑制NF-κB转录激活有关。本研究为深入研究杨梅素如何具体调控炎症信号通路提供了实验依据，为肝脏缺血再灌注损伤的防治提供新的可能治疗靶点。

参考文献:

[7]江平，刘志苏，艾中立.核因子κB在肝缺血再灌注损伤中的表达及意义[J].中华普通外科杂志，2004(3):52

[11]王博，李德芳，韩吉春，等.杨梅素对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究[J].中国新药杂志，2017,26(12):1455

[13]钟正贤，陈学芬，周桂芬，等.广西藤茶中杨梅树皮素的保肝作用研究[J].中药药理与临床，2001(5):11

[14]王健，李鹏飞，韩效帆，等.间断低氧预适应对大鼠肝切除缺血再灌注肝脏凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响[J].国际外科学杂志，2014,41(4):234

[20]李勇，张培建，金成.NF-κB与肝脏缺血再灌注损伤的研究进展[J].中国现代普通外科进展，2008,11(1):48

基金资助:湖北自然科学基金(2024AFB494)；湖北科技学院博士科研启动基金(BK202336);湖北科技学院横向科研经费(2023HX224)；

文章来源:黄兴琼,高满军,张丹丹,等.杨梅素通过调控NF-κB和炎症因子对肝脏缺血再灌注损伤的作用研究[J].湖北科技学院学报(医学版),2024,38(06):467-471.