非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是指排除酒精和其他明显肝损伤因素导致的全身代谢性疾病，其特征为肝细胞内脂肪的过度沉积[1]。NAFLD是世界范围内最常见的慢性肝病，在普通人口中的发病率为25%左右，随着人们生活水平的提高，其发病率呈现逐年上升趋势[2]。NAFLD的病因复杂，目前尚未完全明确，其中“二重打击”学说被普遍接受，肝细胞中脂质过度沉积为第一重打击，氧化应激、内质网应激和炎症等因素引起非酒精性脂肪肝肝炎为第二重打击[3]。目前针对NAFLD的治疗主要为改善生活方式，适当体能锻炼，控制饮食等，仍没有针对其发病机制的特效药物，因此寻找治疗NAFLD的特效药物具有重要意义[4]。

铁是人体中含量最高的微量元素，参与多种机体生命活动，维持体内铁的平衡对人体健康具有重要意义[5]。研究表明，铁超载与NAFLD之间具有密切关联，NAFLD患者常常出现轻、中度的肝脏铁超载[6],沈洁等[7]发现，高铁负荷会加重NAFLD的进展，Salaye等[8]发现，限制小鼠的铁摄入可以减轻小鼠NAFLD的炎症反应。

姜黄素是一种多酚类物质，主要存在于姜科植物中[9]。研究表明，姜黄素对如代谢紊乱、肥胖、炎症、肝脏疾病和恶性肿瘤等多种慢性病具有较好的治疗效果[10,11]。体内外研究显示姜黄素可以干预NAFLD多个病理进程的环节，通过抗氧化应激和炎症反应，发挥治疗NAFLD的作用[12]。但姜黄素是否通过调节机体铁负荷途径改善NAFLD的病程，还有待研究。本研究用姜黄素干预游离脂肪酸诱导的大鼠肝细胞构建的NAFLD细胞模型，同时给予Fe2+刺激，探究姜黄素与铁负荷在治疗NAFLD方面的关系，为NAFLD的临床治疗建立一定的基础。

1、材料与方法

1.1 细胞与试剂

大鼠肝细胞BRL-3A来源于中国科学院上海细胞库，胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司);磷酸盐缓冲液(PBS)、0.25% 胰蛋白酶(北京雷根生物技术有限公司);油酸、棕榈酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);牛血清白蛋白(BSA)-V、放射免疫沉淀(RIPA)法(强)组织细胞快速裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);饱和油红O染色液(上海远慕生物科技有限公司);甲醛、1,2-丙二醇(上海麦克林生化科技有限公司);CCK-8(贝博生物);三酰甘油(TG)测试盒(南京建成生物工程研究所);Trizol(美国ambion公司);qPCR试剂盒(美国KAPA Biosystems公司);蛋白质Marker(美国Helix公司);大鼠铁蛋白酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、抗体铁调素(Hepcidin)、膜铁转运蛋白(Fpn)-1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、山羊抗兔二抗(武汉贝茵莱生物科技有限公司)。

1.2 细胞培养及传代

将BRL-3A大鼠肝细胞培养于10% 灭活胎牛血清的RPMI1640完全培养基中，37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养。用培养液调整细胞密度至1×105个/ml, 24 h后换入含0.1%胎牛血清的培养液中，培养24 h。按1∶3比例传代培养，待细胞呈对数生长时开始实验。

1.3 非酒精性脂肪肝病模型构建及鉴定

将大鼠肝细胞以5×105个/ml接种于6孔板，每孔1 ml, 分为正常组和模型组，每组3孔。待细胞贴壁后，正常组加入含1% BSA的无血清培养基，模型组加入1 mmol/L游离脂肪酸(油酸和棕榈酸2∶1),培养24 h。油红O染色进行模型鉴定。倒掉培养液，PBS漂洗后用10%甲醛固定10 min, PBS漂洗2次，加入预热的油红O染液，65 ℃恒温箱中染色30 min, 80%丙二醇分化1 min, 显微镜下观察背景至无色为止，PBS漂洗3 次后镜检。

1.4 筛选姜黄素作用浓度

收集细胞悬液，接种到96孔板中，过夜培养使细胞贴壁。分别加入0.00、1.25、5.00、10.00、25.00、50.00 μmol/L的姜黄素刺激2 h后，再构建大鼠肝细胞NAFLD模型；收集细胞上清，按照ELISA试剂盒说明书绘制标准曲线并测定细胞内铁蛋白的含量。根据测定的细胞铁蛋白含量，选择合适的姜黄素作用浓度进行后续实验。

1.5 实验分组

实验共分5组：正常组、模型组、姜黄素组、Fe2+组、姜黄素+Fe2+组。正常组肝细胞正常培养；模型组构建NAFLD模型；姜黄素组姜黄素预刺激大鼠肝细胞2 h, 再构建NAFLD模型；Fe2+组构建NAFLD模型的同时加入硫酸亚铁铵共同作用24 h; 姜黄素+Fe2+组姜黄素预刺激大鼠肝细胞2 h, 再构建NAFLD模型同时加入硫酸亚铁铵共同作用24 h。游离脂肪酸浓度为1 mmol/L;硫酸亚铁铵的浓度为0.25 mmol/L,姜黄素的浓度为1.4中筛选出的浓度。

1.6 CCK-8检测细胞存活率

大鼠肝细胞接种到96孔板，3×103个细胞/孔，每孔100 μl, 置 37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜，使细胞贴壁。按照不同分组处理细胞，培养24 h后，向每孔加入10 μl CCK8溶液，继续培养4 h, 在酶联免疫检测仪450 nm处测量各孔的吸光值。

1.7 磷酸甘油氧化酶法检测TG含量

各组肝细胞干预24 h后，匀浆，按体积比1∶100的比例加入样品和工作液，37 ℃孵育10 min, 用酶标仪于505 nm处测定TG的吸光度，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。

1.8 qPCR检测Hepcidin和Fpn-1的mRNA表达

Trizol法提取细胞总RNA,测定RNA的浓度及纯度，将RNA按照Takara反转录试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA,进行PCR扩增。扩增体系：SYBR FAST qPCR Master Mix 10 μl; 上、下游引物各0.5 μl; cDNA模板1 μl; 双蒸水(ddH2O)8 μl。反应程序：95 ℃预变性3 min, 95 ℃变性5 s, 56 ℃退火10 s, 72 ℃延伸25 s, 40个循环。引物序列(5′-3′):Hepcidin正向：GCCTGTCTCCTGCTTCTCC,反向：AGTTGGTGTCTCGCTTCCTT;Fpn-1正向：CATTGGCTGTGGTTTCATT,反向：TCAAGTTCACGGATGTTAGAG;GAPDH正向：CAAGTTCAACGGCACAG,反向：CCAGTAGACTCCACGACAT。上述引物由武汉天一华煜基因科技有限公司合成。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt计算相对表达量。

1.9 Western印迹检测Hepcidin和Fpn-1蛋白表达水平

取出细胞吸去培养基，预冷的PBS洗涤2次，每1×106个细胞加入裂解液(含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂)200 μl, 4 ℃充分裂解细胞，将细胞刮入1.5 ml EP管中，4 ℃ 11 500 r/min离心10 min, 取上清进行蛋白质定量。每孔上样量为20 μg蛋白。将各组样品于12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5 %脱脂奶粉室温封闭4 ℃过夜，按照1∶1 000的稀释比例稀释兔抗Hepcidin、Fpn-1、GAPDH,抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，室温孵育1 h, 洗膜3次后，按照1∶10 000稀释辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1 h。洗膜3次后，将膜放置在暗室中，取适量电化学发光(ECL)液A和B等量混匀，加在膜的正面与之充分接触。然后将膜置于全自动化学发光分析仪中检测，通过TANON GIS软件读取相关条带灰度值。

1.10 统计学分析

用GraphPad Prism8.0进行统计学分析和作图，组间比较采用单因素方差分析。

2、结果

2.1 NAFLD模型鉴定

如图1所示，正常组细胞未见脂滴聚集，油红O染色后未被染上颜色，而模型组细胞可见明显的脂滴聚集，脂滴被染成红色，与正常组差异明显，表明NAFLD模型构建成功。

2.2 姜黄素最佳作用浓度的筛选

姜黄素浓度为0.00、1.25、5.00、10.00、25.00 μmol/L时，细胞内铁含量分别为(297.32±2.02)、(252.89±4.00)、(212.34±4.20)、(173.13±0.62)、(130.01±2.76)pg/ml, 铁含量随着姜黄素浓度的升高而降低，而姜黄素浓度为50 μmol/L时铁含量为[(154.41±1.86)pg/ml]较25 μmol/L时有所升高，姜黄素浓度为25 μmol/L时，铁含量最低，因此本研究选择姜黄素的最佳作用浓度为25 μmol/L。

图1 两组肝细胞(油红O染色，×200)  

2.3 各组肝细胞存活率的比较

与正常组相比，模型组细胞存活率显著降低(P<0.05);与模型组相比，姜黄素组细胞存活率显著升高(P<0.05),Fe2+组细胞存活率显著降低(P<0.05);与Fe2+组相比，姜黄素+Fe2+组细胞存活率显著升高(P<0.05)。见表1。

2.4 各组肝细胞TG含量比较

与正常组相比，模型组TG含量显著升高(P<0.05);与模型组相比，姜黄素组TG含量显著降低(P<0.05),Fe2+组TG含量显著升高(P<0.05);与Fe2+组相比，姜黄素+Fe2+组TG含量显著降低(P<0.05)。见表1。

2.5 各组肝细胞中Hepcidin和Fpn-1mRNA和蛋白表达水平的比较

与正常组相比，模型组Hepcidin mRNA显著降低(P<0.05),Fpn-1 mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型组相比，姜黄素组Hepcidin mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05),Fpn-1 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05),Fe2+组Hepcidin mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05),Fpn-1 mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05),Fpn-1蛋白升高，但差异无统计学意义(P>0.05);与Fe2+组相比，姜黄素+Fe2+组Hepcidin mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05),Fpn-1 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05),见表1、图2。

表1 各组肝细胞存活率、TG含量及Hepcidin、Fpn-1 mRNA和蛋白表达水平比较

图2 各组肝细胞中Hepcidin和Fpn-1蛋白表达   

3、讨论

近年来，由于人们生活水平的提高，高脂肪饮食导致的NAFLD的发病率逐年增加，且越来越趋于年轻化[2]。NAFLD的发病机制复杂，胰岛素抵抗、肠道菌群紊乱、脂毒性、内质网应激等因素均能促进NAFLD的发展[13]。西医治疗NAFLD的方式主要有药物治疗、手术治疗和肝移植等，针对NAFLD的治疗药物主要包括抗氧化剂、肠道菌群调节药物、护肝药和胰岛素增敏剂等，目前仍无用来治疗NAFLD的特效药[14]。游离脂肪酸能够合成TG,过量的TG会引起肝脂肪变性，因此游离脂肪酸常被用于脂肪变性细胞模型的构建[15]。故本研究采用1 mmol/L游离脂肪酸构建NAFLD大鼠肝细胞模型，油红O染色结果可见模型组大鼠中出现大量脂滴聚集，表明模型构建成功。

姜黄素具有抗炎、抗氧化应激、抗纤维化和抗肿瘤等的作用。研究表明，姜黄素对NAFLD具有保护作用，Yan等[16]发现，姜黄素能够明显减轻肝脂肪的变性，Lee等[17]也发现，姜黄素类似物能够改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠的胰岛素抵抗和肝脂肪变性。本研究表明姜黄素对NAFLD大鼠肝细胞具有显著的保护作用。

铁是人体内不可缺少的微量元素，肝脏是脂质代谢和储存铁的主要场所，而NAFLD又同时具有肝脏损伤和脂质过度沉积的特点，因而铁超载与NAFLD之间有着密切的联系[18]。Hepcidin是一种主要由肝细胞合成和分泌的抗菌多肽，是调节铁代谢的关键因子；Fpn是膜铁输出蛋白，能够将细胞内的铁转运到血液中，对于细胞间铁的转运是必需的；Hepcidin与其受体Fpn结合，诱导Fpn内吞继而被溶酶体降解，从而减少铁从十二指肠和巨噬细胞进入血液的水平，因此Hepcidin和Fpn对维持机体的铁稳态具有重要作用[19,20]。研究表明，约1/3的NAFLD患者表现出铁稳态紊乱的迹象，Marmur等[21]发现在NAFLD中血清Hepcidin的水平与铁含量有关，Chen等[22]发现Hepcidin的过表达能够加速NAFLD的发展，Meli等[23]发现饲喂高脂饲料的大鼠血清中Hepcidin的含量增加，而Fpn-1的含量随之下调。本研究结果显示，姜黄素能够显著降低铁蛋白的含量，能够在升高Hepcidin水平的同时降低Fpn-1的水平，表明姜黄素是通过调节铁负荷来保护NAFLD大鼠肝细胞模型的。

综上所述，姜黄素对NAFLD大鼠肝细胞模型具有保护作用，这种保护作用是姜黄素通过调节细胞中铁负荷来实现的。

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基金资助:武汉市卫健委青年项目(WZ19Q02);武汉大学医学部创新种子培育基金(TFZZ2018027);

文章来源:吕琨,李婵,谢萍.姜黄素对非酒精性脂肪肝细胞模型铁负荷的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(07):1735-1738.