蓬莪术是《中国药典》2020年版中莪术的主要来源之一，为姜科植物Curcuma phaeocaulis Val.的干燥根茎[1]。蓬莪术性温，味辛、苦，归肝、脾经，具有行气破血、消积止痛的功效，被誉为“破血消癥要药”。中医临床上常用于治疗癥痕痞块、瘀血经闭。现代药理学研究表明，蓬莪术具有抗肝炎、抗肿瘤、抗氧化等药理作用[2]。蓬莪术醋制品也为中医临床的常用药物，清《本经逢原》载：“莪术，入肝经药醋炒”[3,4]。醋制后蓬莪术主入肝经血分，能增强散瘀止痛的作用。课题组前期发现蓬莪术能通过影响肝组织转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1）/Smads通路延缓肝病进程，醋制后对刀豆球蛋白A所致小鼠肝损伤的保护作用比生品强[5]。醋制后蓬莪术能够更好地调控Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4）/髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response protein88,My D88）/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB）信号通路而发挥抗炎作用，进而改善肝损伤症状[6]。

急性肝损伤（acute liver injury,ALI）是指短时间内由多种原因如自身免疫、酒精、病毒及化学物质等原因引发肝细胞受损的一种疾病，以细胞坏死、炎症和氧化损伤为特征，严重情况下可迅速发展成危及生命的急性肝衰竭（acute liver failure,ALF)[7]。硫代乙酰胺（thioacetamide,TAA）是一种经典的肝脏有毒化合物，可通过引发氧化应激和炎症反应导致器官受损，被广泛应用于构建肝损伤实验模型[8]。研究表明，TAA可导致斑马鱼的ALI，具有与哺乳动物模型相似的病理特征，存在着脂肪变性-纤维化-凋亡的过程[9]。因此，本研究采用模式生物斑马鱼，建立TAA诱导的ALI模型，探究醋制前后蓬莪术水煎液对肝损伤的保护作用，基于核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2）/血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1）信号通路和TGF-β/Smad3信号通路探讨醋制前后蓬莪术水煎液对肝损伤的改善作用机制，为蓬莪术在临床上防治ALI提供科学依据。

1、材料

1.1 动物

AB系野生型斑马鱼，购自国家斑马鱼资源中心，于成都中医药大学西南特色中药资源国家重点实验室斑马鱼实验平台饲养。在28℃、光照14 h/黑暗10 h的环境下，将成熟的健康雌性和雄性AB系野生型斑马鱼分别放养，每天喂2次丰年虾。实验前1晚，将健康的AB斑马鱼成鱼，按雌雄1∶2的比例放入底部有筛网的交配缸内，用透明隔板隔开，次日清晨移除隔板，产卵1 h内观察产卵量并收集鱼卵。

1.2 药材

蓬莪术饮片（批号1903041）购自四川成都荷花池中药材专业市场，经成都中医药大学裴瑾教授鉴定为姜科植物蓬莪术C.phaeocaulis Val.的干燥根茎。醋蓬莪术饮片采用课题组前期专利方法进行炮制（专利号ZL201310400255.2）：取蓬莪术饮片，按10︰3的比例加入9°米醋，搅拌均匀后闷润2 h，煮干醋液后，于120℃干燥30 min，取出放凉，干燥即得。

1.3 药品与试剂

二甲苯（批号2022051901）、无水乙醇（批号2022070501）购自成都市科隆化学品有限公司；苏木素-伊红（HE）染液套装（批号DH0020）购自Leagene公司；中性树胶（批号10004160）购自国药集团化学试剂有限公司；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）试剂盒（批号140122005）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）试剂盒（批号140222005）购自Mindray公司；谷胱甘肽（glutathione,GSH）试剂盒（批号AK06HXZ06586）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）试剂盒（批号AK038P4L0488）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；Animal Total RNA Isolation Kit（批号RE-03014）购自成都福际生物技术有限公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（批号G2003-50T）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；β-actin抗体（批号AF7018）购自美国Affinity公司；Nrf2抗体（批号YT3189）购自美国Immuno Way公司；Smad3抗体（批号ET1607-41）、TGF-β抗体（批号HA721143）购自成都华江生物科技有限公司；HRP标记的山羊抗兔二抗（批号70-GAR0072）、HRP标记的山羊抗小鼠二抗（批号70-GAM0072）购自杭州联科生物技术股份有限公司；异甘草酸镁注射液（批号20211101204）购自南京正大天晴制药有限公司。

1.4 仪器

HM325型切片机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Stepone plus型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；SLAN-96S型全自动医用PCR分析系统（上海宏石医疗科技有限公司）；D3024型台式高速微量离心机、D3024R型台式高速冷冻离心机（美国赛洛捷克SCILOGEX公司）；Chemi Scope 6100型化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。

2、方法

2.1 醋制前后蓬莪术水煎液的制备

取蓬莪术、醋蓬莪术饮片，分别加15倍量去离子水，浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，趁热滤过，合并2次水煎液，50℃减压浓缩，即得醋制前后蓬莪术水煎液。根据《中国药典》2020年版含量测定的方法，经高效液相色谱仪分别测定，蓬莪术水煎液中姜黄素的质量浓度为1.366 mg/m L，呋喃二烯的质量浓度为0.024 mg/m L；醋蓬莪术水煎液中姜黄素的质量浓度为11.907 mg/m L，呋喃二烯的质量浓度为0.018 mg/m L。

2.2 动物分组、造模与给药

在斑马鱼发育至受精后72 h (72 h post fertilization,72 hpf），挑选发育正常的斑马鱼幼鱼，随机分为对照组、模型组、异甘草酸镁（5 mg/m L）组及蓬莪术水煎液高、中、低剂量（8、4、2 mg/m L）组和醋蓬莪术水煎液高、中、低剂量（8、4、2 mg/m L）组。移入12孔板的样孔中，每孔10条幼鱼，每组设置3个复孔。对照组加入2 m L斑马鱼培养水，模型组加入2 m L TAA(8 mmol/L），各给药组加入1 m L TAA(8 mmol/L）和1 m L相应药物，连续3 d于同一时刻给药，初次给药体积为2 m L，此后每天换液一半，以保持药量和水质的新鲜。

2.3 斑马鱼肝脏表型观察

给药后72 h(72 h post exposure,72 hpe），收集各组斑马鱼幼鱼，首先使用三卡因麻醉3 min，然后固定于羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium,CMC-Na）中。调整斑马鱼姿势为侧卧位，在体式显微镜下采集图像，观察斑马鱼肝脏表型。

2.4 HE染色法观察肝脏病理情况

斑马鱼幼鱼的新鲜组织经多聚甲醛固定24 h后，进行脱水、包埋，制作3μm石蜡切片，HE染色后在光学显微镜下观察肝脏组织结构，随机选取视野进行拍照记录。

2.5 斑马鱼幼鱼中ALT、AST活性及GSH、MDA水平的测定

取斑马鱼幼鱼，提取蛋白，用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，按照试剂盒说明书测定ALT、AST活性及GSH、MDA水平。

2.6 q RT-PCR法测定斑马鱼幼鱼中Nrf2、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、Smad3、Smad7 m RNA表达

取斑马鱼幼鱼，提取总RNA，用逆转录试剂盒合成c DNA，将反应得到的c DNA作为模板进行目的基因扩增。PCR反应条件：95℃预变性10 min，循环1次，95℃变性10 s,60℃退火延伸30 s，循环40次。使用PCR仪自带软件进行荧光定量分析，依据Ct值计算2-∆∆Ct，以β-actin为内参基因计算m RNA的相对表达量。引物序列见表1。  

表1 引物序列  

2.7 Western blotting测定斑马鱼幼鱼中Nrf2、Smad3和TGF-β蛋白表达

取斑马鱼幼鱼，提取总蛋白，使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入一抗，4℃孵育过夜，洗膜3次，每次5 min，加入二抗，室温孵育1 h，洗膜3次，每次5 min。采用ECL化学发光成像系统采集图像，用凝胶成像仪自带分析软件分析条带灰度值。

2.8 统计学分析

使用SPSS 22.0统计软件分析结果，数据以±s表示。若符合正态分布，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），进一步两两比较采用LSD-t检验；若不符合正态分布采用非参数检验。利用Graphpad prism 9.3.0软件制作柱状图。

3、结果

3.1 斑马鱼肝脏表型观察结果

如图1所示，异甘草酸镁组斑马鱼肝脏形状均匀，颜色为浅黄褐色；模型组斑马鱼肝脏外观呈褐色，外观粗糙。醋制前后蓬莪术水煎液治疗可缓解上述病理特征。视觉观察结果显示，醋制前后蓬莪术水煎液各给药组之间没有显著的差异。

3.2 斑马鱼肝组织HE染色结果

如图2所示，对照组斑马鱼整体结构未见明显异常，肝脏肝细胞核清晰，胞质较丰富，排列较规则。模型组斑马鱼肝脏出现少量的空泡变性，细胞质中呈现大小不一的圆形空泡，大量肝细胞胞质疏松。与模型组比较，醋制前后蓬莪术水煎液治疗后上述病理损伤均明显减轻。说明醋制前后蓬莪术水煎液对TAA导致的肝组织细胞形态损伤具有保护作用。

图1 斑马鱼肝脏表型图(×100)  

3.3 蓬莪术醋制前后对TAA诱导的斑马鱼幼鱼中ALT、AST活性及GSH、MDA水平的影响

如图3所示，与对照组比较，模型组斑马鱼幼鱼中ALT、AST活性及GSH水平显著降低（P<0.001),MDA水平显著升高（P<0.001）；与模型组比较，醋制前后蓬莪术水煎液组ALT、AST活性及GSH水平显著升高（P<0.05、0.01、0.001),MDA水平显著降低（P<0.001）。其中，与等剂量蓬莪术水煎液组相比，醋蓬莪术水煎液高剂量组ALT活性显著降低（P<0.001），醋蓬莪术水煎液各剂量组AST活性显著降低（P<0.001），醋蓬莪术水煎液高、中剂量组GSH水平显著升高（P<0.01、0.001），醋蓬莪术水煎液中、低剂量组MDA水平显著降低（P<0.01、0.001）。表明蓬莪术醋制后能更好地通过缓解氧化应激达到改善TAA诱导肝损伤的目的。

图2 斑马鱼肝组织HE染色结果(×400)   

3.4 蓬莪术醋制前后对TAA诱导的斑马鱼幼鱼中Nrf2、IL-10、Smad3、Smad7 m RNA表达的影响

如图4所示，与对照组比较，模型组斑马鱼幼鱼中Nrf2、IL-10、Smad7 m RNA表达水平显著降低（P<0.001),Smad3 m RNA表达水平显著升高（P<0.001）；与模型组比较，醋制前后蓬莪术水煎液高、中剂量组Nrf2、IL-10 m RNA表达水平均显著升高（P<0.05、0.01、0.001），蓬莪术水煎液高、中剂量组和醋蓬莪术水煎液高剂量组Smad7 m RNA表达水平显著升高（P<0.05、0.01、0.001），醋蓬莪术水煎液高剂量组Smad3 m RNA表达水平显著降低（P<0.001）。其中，与等剂量蓬莪术组相比，醋蓬莪术水煎液高剂量组显著抑制Nrf2、Smad3的m RNA表达（P<0.05、0.001），且醋蓬莪术水煎液具有促进IL-10和Smad7 m RNA表达的趋势，但没有显著性差异。

图3 蓬莪术醋制前后对TAA诱导的斑马鱼幼鱼中ALT、AST活性及GSH、MDA水平的影响(±s,n=3)

3.5 蓬莪术醋制前后对TAA诱导的斑马鱼幼鱼中Nrf2、Smad3、TGF-β蛋白表达的影响

如图5所示，与对照组比较，模型组斑马鱼幼鱼中Smad3和TGF-β蛋白表达水平显著升高（P<0.001),Nrf2蛋白水平显著降低（P<0.001）；与模型组比较，蓬莪术水煎液高、中剂量组和醋蓬莪术水煎液各剂量组Nrf2蛋白表达水平显著升高（P<0.001），蓬莪术水煎液高剂量组和醋蓬莪术水煎液各剂量组Smad3蛋白表达水平显著降低（P<0.05、0.01、0.001），蓬莪术水煎液高剂量组和醋蓬莪术水煎液高、中剂量组TGF-β蛋白表达水平显著降低（P<0.05、0.01、0.001）。其中，与等剂量蓬莪术水煎液组相比，醋蓬莪术各剂量组Nrf2蛋白表达水平显著升高（P<0.001），且醋蓬莪术具有抑制Smad3和TGF-β蛋白表达的趋势，但没有显著性差异。结果表明，醋制前后蓬莪术水煎液可通过调节Nrf2/HO-1信号通路和TGF-β/Smad3信号通路对TAA诱导的斑马鱼急性肝损伤发挥潜在的保护作用。

图4 蓬莪术醋制前后对TAA诱导的斑马鱼幼鱼中Nrf2、IL-10、Smad3、Smad7 m RNA表达的影响(±s,n=3)   

图5 蓬莪术醋制前后对TAA诱导的斑马鱼幼鱼中Nrf2、Smad3、TGF-β蛋白表达的影响(±s,n=3)  

4、讨论

斑马鱼作为一种新兴模式生物，具有多种独特的优势，在药理学和毒理学研究中应用广泛。斑马鱼具有发育周期短、繁殖能力强、高通量化和快速筛选等特点，遗传学分析表明斑马鱼的基因组与人类超过87%的同源性，其基因信号传导通路和代谢通路也与人类高度保守性[10]。此外，斑马鱼肝脏有许多和哺乳动物类似的反应，如对外源化学物质的防御机制相当，以及脂类和糖原储存。斑马鱼幼鱼通体透明，可以直接活体观察其器官的发育和功能。因此相对于其他模式动物，斑马鱼在建立肝损伤模型方面具备较为显著的优势[9]。周楚莹等[11]采用二乙基亚硝胺构建斑马鱼药物性肝纤维化模型，发现牛大力水提物对药物性肝纤维化损伤的保护作用是通过抑制肝细胞凋亡、减少胶原纤维沉积实现的。崔佳琦等[12]通过构建斑马鱼兴奋期醉酒模型、醉酒模型及酒精性肝损伤模型，结果表明各剂量茯苓-葛根-枳椇子混合药粉均有不同程度的预防醉酒作用、解酒作用及肝损伤保护作用。孟瑞媛等[10]通过构建黄曲霉毒素B1诱导的斑马鱼肝损伤模型，结果表明姜黄素通过调节与脂肪合成、抗氧化和能量代谢相关的通路，起到了修复肝损伤的作用。课题组前期采用flk1-EGFP转基因斑马鱼研究姜黄抗血管生成的作用[13]。因此，本研究采用了新型模式斑马鱼探究蓬莪术醋制前后对肝损伤的缓解作用。

ALT和AST是反映肝损伤的标志性酶，ALT主要位于肝细胞细胞质中，AST在肝细胞线粒体中含量最高，常用于肝脏疾病的诊断[14]。本研究中，TAA诱导的斑马鱼幼鱼肝损伤后，模型组ALT和AST活性均显著低于对照组。在TAA引起肝损伤后，肝细胞合成ALT和AST的能力降低[15]。从整个动物模型的角度来看，斑马鱼幼鱼的ALT和AST活性也降低了，因此组织匀浆中ALT和AST的总活性可能会降低。GSH是平衡氧化与抗氧化中重要的抗氧化酶，可以清除细胞内氧自由基，反映机体抗氧化能力；MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，可以提示机体内过量产生活性氧的程度[16]。本研究中，醋制前后的蓬莪术治疗后，GSH水平均不同程度的升高，MDA水平均不同程度的降低，呈剂量相关性。表明抑制氧化应激可能是醋制前后蓬莪术改善斑马鱼幼鱼肝损伤的途径之一。

氧化应激和炎症反应在介导急性肝损伤的发生和发展过程中有至关重要的作用，抑制氧化应激和炎症被认为是治疗肝损伤的重要策略[17]。Nrf2是一种内源性调控因子，被活性氧和抗氧化剂等多种元素激活后进入细胞核，与抗氧化反应元件（antioxident response element,ARE）结合，进而调节体内多种抗氧化酶的表达，发挥抗氧化功能。HO-1是Nrf2信号的下游靶基因，能够通过降解亚铁血红素生成一氧化氮等产物参与氧化应激损伤等病理生理过程，Nrf2/HO-1通路对机体抵抗氧化应激损伤具有积极的正向作用[18]。q RT-PCR和Western blotting结果显示，与对照组比较，模型组Nrf2m RNA和蛋白表达量减少可能是由于在TAA诱导氧化损伤情况下，肝细胞需要持续地合成足够的Nrf2去应对氧化应激，而肝脏的损伤使Nrf2合成不足，从而出现了Nrf2 m RNA和蛋白表达量减少的情况。与模型组比较，醋制前后蓬莪术水煎液组Nrf2m RNA和蛋白表达量升高，表明醋制前后蓬莪术水煎液组可能通过促进Nrf2的合成来提高其基础水平，从而减轻TAA诱导的肝脏损伤，并逐渐降低机体的氧化应激水平，使其恢复正常。

TGF-β具有特定的自分泌和旁分泌作用，能介导白细胞群体内炎症细胞的活化、迁移和增殖的调节，是调节组织炎症和修复的重要细胞因子[19]。Smad3是一种膜受体激活的Smad，参与TGF-β/活化素信号途径。许多研究已经证实，TGF-β/Smads信号传导途径是TGF-β发挥生物学作用的主要机制。TGF-β的异常表达不仅促进肝癌细胞的增殖、迁移，而且与病毒性肝炎、肝功能衰竭以及其他慢性肝病等多种肝脏疾病相关[20]。q RT-PCR和Western blotting结果显示，与模型组比较，醋制前后蓬莪术水煎液能显著下调Smad3 m RNA表达水平，降低Smad3和TGF-β的蛋白表达量，提示醋制前后蓬莪术水煎液可抑制TGF-β表达，降低激活的Smad的表达，抑制肝细胞内TGF-β/Smads信号通路，从而发挥对ALI的保护作用。

课题组前期采用质谱法发现蓬莪术醋制前后的主要差异成分是没食子酸、阿魏酸、莪术醇、常春藤素[21]。研究发现没食子酸对于肝脏损伤具有保护作用，其机制可能与增强抗氧化损伤能力、降低炎症因子水平有关[22]。阿魏酸糖酯能够激活Nrf2抗氧化信号通路，促进Nrf2/Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)-ARE抗氧化信号通路下游相关抗氧化酶的表达，从而有效保护大鼠免受AAPH诱导的氧化损伤[23]。莪术醇可以下调TGF-β1和Smad2/3蛋白和基因的表达，从而阻止TGF-β1/Smad信号通路的活动达到抗肝纤维化的作用[24]。常春藤素对肝脏损伤有显著的抑制效果，还能减少肝脏氧化应激，同时对小鼠的体质量也有明显的抑制作用[25]。这些差异性的成分可能是蓬莪术醋制前后药效变化的物质基础，将进一步研究这些单体成分对斑马鱼肝损伤的保护作用。

本研究基于Nrf2/HO-1信号通路和TGF-β/Smad3信号通路探究醋制前后蓬莪术水煎液对TAA诱导ALI斑马鱼的保护作用机制。结果表明，醋制前后蓬莪术水煎液均可改善TAA诱导的ALI斑马鱼幼鱼的一般生理状态及肝脏损伤程度，调控Nrf2/HO-1信号通路和TGF-β/Smad3信号通路，改善肝脏氧化应激和炎性反应发挥作用。研究发现与蓬莪术相比，醋蓬莪术调节TGF-β/Smad3信号通路水平更具有降低的趋势，说明蓬莪术醋制后抗炎的效果更好。本研究初步阐明蓬莪术“醋制入肝”的炮制机制，为蓬莪术的临床应用提供实验依据，同时为蓬莪术防治ALI提供了理论依据。

参考文献:

[1]中国药典[S].一部. 2020:13, 286.

[2]高天慧,廖婉,傅超美,等.基于pH值动态变化的川产道地药材蓬莪术醋制前后化学成分差异研究[J].中草药, 2017, 48(24):5174-5178.

[3]清·张璐.本经逢原[M].北京:中国中医药出版社,1996:157.

[5]汪蕾.川产道地药材蓬莪术醋制前后“成分—吸收—药效”差异性研究[D].成都:成都中医药大学, 2017.

[7]唐浪,宋添力,吴广阳,等.土家药竹节参多糖通过Nrf2-ARE信号通路对四氯化碳致大鼠急性肝损伤的抗氧化保护作用[J].中草药, 2023, 54(15):4866-4873.

[8]宋磊.伊赫汤及姜黄素对硫代乙酰胺诱导的斑马鱼幼鱼肝纤维化的抑制作用[D].通辽:内蒙古民族大学,2023.

[9]齐玉娟,张靖溥.硫代乙酰胺诱导的斑马鱼急性肝损伤模型[J].药物分析杂志, 2014, 34(5):782-789.

[10]孟瑞媛,卯明彩,宋晓,等.姜黄素对黄曲霉毒素B1诱导的斑马鱼肝损伤的修复作用[J].农产品质量与安全, 2023(2):33-39.

[11]周楚莹,赖裕玲,谢凌鹏,等.牛大力水提物对斑马鱼药物性肝纤维化损伤的保护作用[J].新中医, 2018,50(12):12-16.

[12]崔佳琦,彭桂英,冯昊天,等.茯苓-葛根-枳椇子混合药粉对斑马鱼解酒保肝作用研究[J].现代中药研究与实践, 2022, 36(6):24-28.

[13]朱宗萍,王继森,廖婉,等.基于模式生物斑马鱼研究姜黄抗血管新生的作用及机制[J].中草药, 2021,52(11):3257-3268.

[14]姜炅,袁佳,史海涛,等.血清ALT､AST联合NFS评分对非酒精性脂肪性肝硬化患者食管胃底静脉曲张严重程度的评估价值[J].中西医结合肝病杂志, 2020,30(4):314-317.

[18]张霖.活化Nrf2上调HO-1表达抑制C57小鼠深静脉血栓形成的研究[D].昆明:昆明医科大学, 2019.

[19]叶蕾,余亚平,陈芝芸,等.补肾化瘀方对肝纤维化大鼠肝组织TGFβ1/Smad3表达的影响[J].浙江中医杂志, 2018, 53(12):869-870.

基金资助:国家自然科学基金面上项目(82274099);四川省自然科学基金面上项目(24NSFSC1101);成都市科技局国合项目(2022-GH02-00033-HZ);

文章来源:林丽婷,王继森,高天慧,等.蓬莪术醋制前后改善斑马鱼急性肝损伤的作用机制研究[J].中草药,2024,55(08):2611-2619.