代谢相关脂肪性肝病可由遗传、环境、代谢应激等多种相关因素所致，是以肝细胞内脂肪堆积为主的病理综合症[1]。近年来，随着社会经济发展和人们生活水平的不断提高，代谢相关脂肪性肝病的患病率逐渐增高，并且已经成为威胁人们健康的重要肝病之一[2]。中医认为，脂肪肝的产生是由于过食肥甘厚味或情志失调等因素引起的肝失疏泄、脾失健运、痰瘀互结、聚滞为积等，终致积滞之实[3]。如不进行及时治疗，严重者可发展成为肝纤维化、肝硬化等恶性疾病，严重威胁生命健康。积雪草是伞形科植物，始载于《神农本草经》，具有清热解毒、消肿止痛等功效。其组成中含有积雪草苷、积雪草二酸、羟基积雪草苷等多种化学成分，其中积雪草苷是最为主要的活性成分之一[4]。近年来相关研究发现，积雪草苷不仅具有抗肿瘤、抗抑郁、抑菌、抗肝纤维化等多种生物活性，还对改善肝脏等多种器官功能具有一定作用，但对于代谢相关脂肪性肝病作用的机制现阶段还鲜见报道[5]。在代谢相关脂肪性肝病形成过程中，氧化应激和脂质过氧化起着非常重要的作用，可在胰岛素抵抗基础上产生的氧化应激和脂质过氧化，因为整个过程中产生过多的活性氧簇（ROS）等可引起细胞炎症，导致肝脂肪沉积加重[6]。核因子E2相关因子2(Nrf2）信号通路可减少高糖环境下活性氧的产生，发挥其抗氧化应激损伤的作用，并在相关病变的防治中具有重要意义，但对于其在代谢相关脂肪性肝病中的作用机制的研究较少，仍需进一步探究[7]。本研究探究了积雪草苷对代谢相关脂肪性肝病大鼠Nrf2、ROS的影响。

1、材料与方法

1.1 实验动物

选取60只健康雄性大鼠，4～6月龄，体质量150～200 g，由湖南医科大学动物学部提供，使用许可证号SCXK(湘)2019-0035，所有大鼠均在南方医院肺病中心实验室饲养，饲养温度为20～25℃，相对湿度40%～60%，日常光照，自由饮食饮水。动物实验经本院动物实验伦理委员会批准（批准号HNZYY-2019007）。

1.2 实验试剂与仪器

积雪草苷（上海源叶生物科技有限公司，质量分数≥98%，货号B20586-20mg）；双环醇片（北京协和药厂，规格25 mg/片，批号J722029）；抗体Nrf1（上海康朗生物科技有限公司，货号kl669Ra21);Nrf2、辣根过氧化酶标记抗兔Ig G（上海彩佑实业有限公司，货号52179R、C-8255）；柠檬酸缓冲液（深圳海思安生物技术有限公司，货号JPH233);PCR试剂盒（北京伊塔生物科技有限公司，货号YT9033）；苏木精–伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号G1120）。

1.3 模型建立

代谢相关脂肪性肝病大鼠模型建立依据文献报道[8]，采用高脂饲料（80%基础饲料+10%猪油+5%蛋黄粉+1%胆固醇）喂养大鼠，并造模后第1天ip四环素5 mg/100 g，后以10 mg/100 g，每6天ip 1次，共6次，期间称质量并调整药量，高脂饮食持续4周。建模后用油红O染色观察肝组织脂滴分布，取5μm肝脏切片，每张切片随机取5个视野，采用Image-Pro plus6.0图像分析，以肝脏边界圆钝、包膜紧张、切面油腻、体积增加、淡黄色视为建模成功。

1.4 分组与给药

将所有大鼠分为对照组、模型组、积雪草苷（5、15、30 mg/kg）组、双环醇组，每组10只。除对照组外均建立代谢相关脂肪性肝病大鼠模型，建模成功后，对照组与模型组ig 10 m L/kg生理盐水，1次/d；参考《中药药理研究方法学》[9]中方法根据人和大鼠的计量折算系数确定所给药量，积雪草苷（5、15、30 mg/kg）组分别ig 5、15、30 mg/kg积雪草苷，1次/d。双环醇组ig 20 mg/kg双环醇，均连续干预4周。

1.5 方法与检测

1.5.1 ELISA检测大鼠血清中天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）水平

大鼠麻醉后抽取腹部静脉血1 m L,5℃，3 000 r/min离心15 min，取上清液，检测ALT、AST、TC、TG水平，操作步骤严格按照说明书标准进行测定。

1.5.2 荧光探针–二氢乙啶（DHE）法检测ROS表达

待大鼠麻醉后处死打开腹腔，在肝脏最大叶距边缘取肝组织，低温预冷后10μm切片，将稀释液滴于组织，常温孵育，洗涤，荧光显微镜下拍摄图像，红色为阳性细胞，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计算平均吸光度（A）值。

1.5.3 HE染色

取大鼠肝组织10%甲醛固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、3μm切片并烘干后，加二甲苯、无水酒精，脱蜡，梯度乙醇，蒸馏水浸泡3 min,HE染色，风干后中性树胶封片，光学显微镜下观察拍照。

1.5.4 免疫印迹检测Nrf1、Nrf2蛋白表达

取肝组织裂解后提取蛋白质并测定含量，电泳，移膜，5℃封闭过夜，加兔抗鼠一抗Nrf1(1∶5 000）、Nrf2(1∶4 000）、β-actin(1∶2 000）孵育1 h，洗涤，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ig G(1∶5 000）孵育1 h，洗涤，曝光，显影，获取图象。

1.5.5 PCR检测Nrf1、Nrf2 m RNA表达

将肝组织研磨匀浆后提取总RNA，逆转录合成c DNA，以β-actin为内参进行PCR扩增，70℃、5 min,85℃、3 min,65℃、3 min,50℃退火30 s,65℃延伸15 s，循环30次，以β-actin为内参，实时荧光定量PCR仪测量基因表达，计算2-ΔΔCt值，见表1。  

表1 引物序列 

1.6 统计学方法

采用Graph Pad Prism 8.0软件统计分析，计量资料用表示，多组间比较用单因素方差分析。

2、结果

2.1 各组大鼠血清中ALT、AST、TC、TG水平

与模型组比较，积雪草苷15、30 mg/kg组大鼠ALT、AST、TC、TG水平显著降低（P<0.05）；积雪草苷15 mg/kg组与双环醇组血清中ALT、AST、TC、TG水平无显著差异，见表2。

2.2 各组ROS荧光表达

与模型组比较，积雪草苷15、30 mg/kg组ROS荧光表达显著降低（P<0.05），而积雪草苷15 mg/kg组与双环醇组ROS荧光表达比较显著无差异，见图1、表3。

2.3 各组大鼠肝组织HE染色表达

对照组大鼠肝脏组织结构完整，肝细胞排列整齐，小叶结构完好，呈放射状分布，细胞核位于中央，胞浆分布均匀，无细胞坏死、脂肪变性和炎症现象；模型组、积雪草苷5 mg/kg组大鼠肝脏组织肝组织空泡样脂肪变性明显，脂肪含量增多，细胞间排列紊乱，胞浆内存在大量脂肪及炎性细胞浸润；积雪草苷15 mg/kg组、双环醇组大鼠肝细胞脂肪变性有所减轻，细胞排列稍显紊乱，其中散在少数炎细胞，汇管区见少量炎细胞浸润；积雪草苷30 mg/kg组大鼠肝脏的脂肪蓄积降低、脂肪细胞变小，细胞排列稍显不整齐，其中个别炎细胞散落，脂肪浸润明显改善，见图2。  

表2 各组大鼠血清中ALT、AST、TC、TG水平

图1 各组ROS表达（DHE)    

表3 各组ROS荧光表达 

图2 HE染色结果（HE，×200)   

2.4 各组大鼠肝组织中Nrf1、Nrf2 m RNA表达

与模型组比较，积雪草苷15、30 mg/kg组大鼠肝组织中Nrf1、Nrf2 m RNA表达量显著升高（P<0.05），而积雪草苷15 mg/kg组与双环醇组肝组织中Nrf1、Nrf2 m RNA表达量无显著差异，见表4。  

表4 各组大鼠肝组织中Nrf1、Nrf2 m RNA表达  

2.5 各组大鼠肝组织中Nrf1、Nrf2蛋白表达

与模型组比较，积雪草苷15、30 mg/kg组大鼠肝组织中Nrf1、Nrf2蛋白相对表达量显著升高（P<0.05）；而积雪草苷15 mg/kg组与双环醇组肝组织中Nrf1、Nrf2蛋白表达量比较无显著差异，见图3、表5。

图3 各组Nrf1、Nrf2蛋白相对表达量    

表5 各组大鼠肝组织中Nrf1、Nrf2蛋白相对表达量 

3、讨论

代谢相关脂肪性肝病的发生与高血压高血脂症、肥胖、胰岛素抵抗、药物损害、代谢综合征和遗传易感性等多种因素密切相关。据统计，约25%的代谢相关脂肪性肝病患者会产生疲乏感，如不及时治疗较易发展成中度或重度代谢相关脂肪性肝病，并导致患者肝区隐痛、全身乏力、腹泻等严重不良反应产生，继而影响患者的正常生活[9]。中医药在辅助治疗该病方面取得一定进展[10]。

肝部疾病发生时，血清中ALT、AST、TC、TG均与疾病的发生发展存在一定的相关性，其过量的表达可造成组织及细胞的损伤，进而促进疾病的发展[11]。本研究中，与模型组相比，积雪草苷15、30mg/kg组及双环醇组以上指标均显著降低（P<0.05），表示积雪草苷对于降低代谢相关脂肪性肝病大鼠血清中ALT、AST、TC、TG指标具有一定影响。相关研究表示，在脂肪肝发生时组织中炎症反应被激活，使合成胆固醇的各个环节均可发生障碍，导致ALT、AST、TC、TG等血清胆固醇指标的合成显著升高，干扰了肝脏内脂类代谢，并为脂肪肝的脂质过氧化形成反应提供了足够的反应基质，导致了肝细胞进一步坏死、凋亡，使得肝损伤程度加重[12]。积雪草为伞形科鸡血草属植物，用于疾病的治疗已有2000多年历史。主治湿热黄疸、中暑腹泻、砂淋血淋、痈肿疮毒、跌扑损伤，具有良好的降低血糖、改善胰岛素抵抗、清热解毒、利湿消肿等功效[13]。植物化学研究中发现，积雪草的全草主要化学成分为B-谷甾醇、胡萝卜苷、积雪草酸、香草酸和积雪草苷。积雪草苷为积雪草提取物中三萜皂苷的主要成分之一[14]。现代药理研究表示，积雪草苷具有较强的药理活性，可促进伤口愈合、刺激生物合成、抗溃疡、抗炎、抗肿瘤、抗抑郁等多种药理学作用，还对麻风杆菌、结核杆菌感染有一定治疗作用，临床上常用于慢性炎症、皮肤病等多种疾病的治疗[15]。但对于积雪草苷在代谢相关脂肪性肝病疾病中治疗的作用机制目前研究较少，仍需进一步探究。赵嗣霞等[16]在积雪草苷抗大鼠免疫性肝纤维化作用研究中表示，积雪草苷在肝损伤中可能通过抑制肝组织中一氧化氮（NO）合成酶的活性，抑制肝细胞中鸟苷酸环化酶等因子的转化，并通过抑制其与合成酶、水解酶等的动态表达，降低组织内ALT、AST、TC、TG等因子水平。由此推测，积雪草苷在治疗代谢相关脂肪性肝病中可能通过增加大鼠体内对胰岛素的敏感性、减少脂肪堆积，从而降低血脂沉积、改善肝功能，抑制脂肪肝的发展。

ROS作为氧化酶合成的效能产物，具有较强的氧化攻击性，在疾病中可直接损伤细胞膜、细胞器及重要的蛋白信号因子，造成细胞膜和细胞膜脂质的过氧化导致肝损伤加剧[17]。本研究中，与模型相比，积雪草苷15、30 mg/kg组及双环醇组ROS显著降低（P<0.05），表示积雪草苷对于抑制代谢相关脂肪性肝病大鼠ROS表达具有积极作用。相关研究表示，氧化应激和脂质过氧化是由多种原因引起脂肪肝形成和进展的共同机制。脂质过氧化不仅可对肝脏脂类代谢进行干扰还造成过度脂质沉积及过氧化。ROS升高可使脂质过氧化物及终产物含量增加，导致肝组织抗氧化能力减弱。因此，抑制ROS活性并使其消耗增多对于脂肪肝疾病的治疗至关重要[18]。积雪草苷能够抑制氧自由基的产生，促使病灶部位产生大量的谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等清除剂。积雪草苷通过下调NOX4及相关合成酶的表达减少ROS的生成，降低肝脏氧化应激和炎症、过氧化反应，增加肝组织抗氧化能力，抑制脂质过氧化物终产物，平衡肝内脂类代谢，减缓脂肪肝损伤程度[19]。

Nrf1、Nrf2不仅可在脏器、肠道等组织细胞中有所表达，还可参与氧化应激调节过程[20]。本研究中，与模型组相比，积雪草苷15、30 mg/kg组及双环醇组Nrf1、Nrf2蛋白和m RNA相对表达量显著升高（P<0.05），表示积雪草苷对于增加代谢相关脂肪性肝病大鼠肝组织中Nrf1、Nrf2具有积极作用。Nrf2是抗氧化机制的中心关键因子，同时也是肝胆中相关转运蛋白的关键调节器。Chowdhry等[21]在用缺乏蛋氨酸和胆碱的食物喂养缺乏Nrf2的小鼠实验中表示，Nrf2缺乏的小鼠肝组织中有更多大小水泡样脂肪变性及中性粒细胞多晶型物，且炎症反应更重，肿瘤坏死因子、环氧酶及诱导NO合酶也大幅升高，可加重代谢相关脂肪性肝病的肝损伤。该结果与本文研究相类似。由此推测，积雪草苷可能在与抗氧化因子结合的过程中激活了Nrf1、Nrf2，并在过程中通过调节抗氧化反应元件从而启动肝细胞抗氧化应激、脂质过氧化的保护机制。

综上所述，积雪草苷对代谢相关脂肪性肝病大鼠具有一定的保护作用，该作用可能与降低ALT、AST、TC、TG表达，抑制ROS表达，增加Nrf1、Nrf2的表达具有一定相关性。

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文章来源:王迎迎,顾永政.积雪草苷对代谢相关脂肪性肝病大鼠Nrf2､ROS通路表达的影响[J].现代药物与临床,2024,39(04):810-815.