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BTG2在高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝中的表达及意义

2024-05-30 32 上传者：管理员

摘要：目的探讨BTG2在高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝中的表达及意义。方法将45只SPF级雄性C57BL/6小鼠随机分成为正常对照组(n=10)和模型组(n=35)。在模型组(n=35)连续高脂饮食16周，建立小鼠非酒精性脂肪肝模型。通过实时荧光定量PCR法、免疫组织化学法检测BTG2的表达量和蛋白表达水平，采用苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织病理学改变。结果实时荧光定量PCR法检测BTG2在肝脏组织中的表达水平，与对照组相比BTG2的表达量和蛋白表达水平在模型组中显著提高。免疫组织化学法检测结果显示：与对照组相比，模型组中的BTG2蛋白质表达水平显著上调(P<0.01)。结论通过实时荧光定量PCR法、免疫组织化学法检测发现在高脂饮食诱导小鼠肝纤维化模型中的BTG2表达量均显著升高。

关键词：
BTG2
小鼠
脂质代谢紊乱
非酒精性脂肪肝
高脂饮食
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非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD )是一种与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病等密切相关的慢性代谢性疾病，被认为是代谢综合征在肝脏中的的表现[1]。近年来，随着肥胖、2型糖尿病的流行，以及全球的人口老龄化，我国NAFLD平均患病率已达32.9%,与西方国家患病水平相当[2,3];亚太地区肥胖或糖尿病患者NAFLD的患病率高达70%～90%[4]。如果不伴有炎症(纤维化),单纯性脂肪变性通常被认为是NAFLD的早期阶段。然而，脂肪变性伴炎症(纤维化)被认为是晚期病变，并可能发展为其他晚期肝病，如肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)。根据NAFLD发病机制认为，脂肪变性、胰岛素抵抗和脂质失调是NAFLD的“首次打击”,可自发引发氧化应激、炎症、坏死、细胞凋亡和纤维化等后续“二次打击”。因此，无论在基础研究还是临床试验中，在NAFLD的早期靶向治疗脂肪变性和胰岛素抵抗对于延缓NAFLD的发展都具有极其重要的意义。作为B细胞易位基因(BTG)/TOB家族成员之一的BTG2,具有明显的抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和导致细胞周期停滞的作用，常常在细胞受到应激反应时或者在受到多种基因毒性介质(电离辐射、紫外线、阿霉素、生长因子、雌激素、血清、醋酸十四烷酰佛波、白介素6和环磷酸腺苷)的影响下表达增高[5,6,7,8,9]。BTG2的表达在功能上与脂肪细胞分化相关，已有研究表明，作为肝糖异生刺激剂的BTG2在脂肪细胞中可显著增加一系列早期反应[10]。此外，BTG2作为一种cAMP应答元件结合蛋白的共激活剂，积极调节肝脏糖异生[11]。这些结果强烈提示BTG2可能是开发新型肝脏疾病治疗剂的关键靶点。那么，在高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝的病理过程中，BTG2的表达是否也会受到脂质代谢异常的影响，目前不得而知，需要进一步探索。因此，我们通过构建NAFLD小鼠模型来研究肝脏中BTG2的表达情况，为BTG2作为治疗肝脏疾病的靶点提供一定的理论基础。

1、材料与方法

1.1实验动物

40只SPF级6周龄雄性C57BL/6小鼠，体重(20±2)g。所有动物饲养在贵州医科大学动物实验中心恒温22～24℃,相对湿度50%～60%,光照/黑暗周期12 h,自由饮水的条件下饲养。

1.2药物与试剂

DMEM/F12培养基、澳洲胎牛血清、Triz 01试剂(Invitrogen);RIPA裂解液(碧云天);PVDF膜(Whatman);GAPDH抗体、兔抗和鼠抗(Protein Technology);BTG2抗体(Protein.tech);AKT抗体(Signalway antibody)。

1.3主要仪器

DNA连接反应水浴锅，英国GRANT公司；DYY-BC电泳仪、北京六一生物科技有限公司；CFX96荧光定量聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)仪，美国伯乐公司产品；仪器SN267839连续波长酶标仪，美国BioTek公司产品；C600凝胶成像系统，Azure公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技有限公司。

1.4方法

1.4.1分组与造模

将45只4周龄C57小鼠适应性饲养7 d后，随机分为空白组(10只)和模型组(35只)。实验中涉及的非酒精性脂肪肝模型小鼠通过给予高脂饲料(酪蛋白233.06 mg、蔗糖201.36 mg、玉米淀粉84.83 mg、麦芽糖糊精116.53 mg、猪油206.84 mg、大豆油29.13 mg等)喂养16周，体重超过干预前体重的25%判定造模成功。

1.4.2动物一般状态

实验过程中每日观察并记录各组小鼠的精神、饮食、活动、体重、皮毛等情况。

1.4.3小鼠肝组织形态学变化

取出小鼠部分肝脏组织，以4%多聚甲醛固定24 h,流水冲洗数小时(3～8 h),浓度梯度酒精法进行脱反复脱水、二甲苯透明、浸蜡、组织、包埋、组织切片、贴片、化蜡、封闭、孵育一抗、二抗等按标准流程进行。然后镜下观察，并染色观察肝组织病理学变化。

1.4.4实时荧光定量PCR法检测小鼠肝组织中BTG2的表达水平

取小鼠肝脏组织80 mg,加入TRIzol后剪刀剪碎并，在-80℃冰箱预冷并研磨器研磨并加入氯仿，12 000 g的离心后可见EP管中出现分层，上层为透亮色，下层为粉红色，将上层吸取液体转移至另一个EP管中，滴加氯仿，加入冰箱预冷的异丙醇，剧烈震荡使其充分混匀，离心10 min, 70%乙醇震荡，离心弃上清液，加入DEPC水溶解RNA,1μl溶解的RNA,紫外分光光度计测量RNA的浓度和纯度。按照试剂盒要求及说明书合成cDNA,设计引物。反应条件：预变性95℃30 s变性95℃10 s退火65℃10s延伸72℃30 s,其中变性95℃10 s退火65℃10 s延伸72℃30 s这个过程循环40次。以GAPDH为内参进行PCR扩增。

1.4.5肝细胞培养

快速取下小鼠肝脏，用D-Hank’s缓冲液冲洗表面的血液，然后放入到平皿中，向其中加入无血清RPMI1640培养基，用眼科镊轻轻的撕破肝脏被膜，然后用眼科镊夹住肝脏被膜轻轻振荡使细胞脱落，收集肝脏细胞悬液；用70μm细胞筛网过滤，将过滤的细胞悬液在离心机中以55 g离心3 min。离心后弃上清，留下细胞沉淀，将细胞沉淀用无血清RPMI1640培养基重悬后再以同样参数离心1次；将取得的细胞沉淀重悬后再以55 g离心2 min。用培养基将沉淀重悬，然后接种于包被Ⅰ型鼠尾胶原的培养皿中，为了诱导原代肝细胞脂肪变性，这些细胞将用0.5 mmol/L的PA诱导24 h。

1.4.6免疫组化

将肝脏组织取出后用PBS快速冲去血迹，放置在4%多聚甲醛中。将肝脏组织依次放入70%～100%的酒精中，每种浓度的酒精中保持4 h,经过二甲苯透明，然后放入加热成液体状石蜡中，包埋好的蜡块切成5μm的蜡带，展片器使蜡带贴在载玻片上。放置于37℃的干燥烤箱中保持12 h,二甲苯化蜡，抗原修复，羊血清室温下封闭，加一抗湿盒中4℃冰箱放置16 h。PBS洗涤一抗，加二抗湿盒中37℃烤箱放置60 min,苏木素或者DAPI进一步染细胞核2 min,经脱水和透明后，进行封片，显微镜成像系统拍照。

1.5统计学方法

采用SPSS23.0软件进行方差分析；采用GraphPad Prism 8软件进行作图。

2、结果

2.1一般情况

正常对照组小鼠一般情况、体质量及肝质量的变化实验过程中各组小鼠均状态良好，食欲旺盛。正常组小鼠性情较为温顺，皮毛光滑，活动正常。模型组小鼠进食量、体质增长迅速，且反应稍迟钝，不喜动。至第14周、第15周和第16周时模型组小鼠的体质量与正常组比较均升高。而肝质量至第14周和第16周时与正常组比较均有升高。

2.2高脂饮食诱导NAFLD模型

经高脂饮食喂养后，小鼠体重明显升高。HE染色发现，对照组小鼠肝脏组织中未见明显损伤，而与对照组相比，模型组肝细胞胞浆内含有多个大小不等的脂肪空泡，表明肝脂肪变性。见图1。

图1高脂饮食诱导NAFLD模型的建立

2.3 BTG2在高脂饮食诱导的模型中表达升高

通过qRT-PCR的使用，检测高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠模型中BTG2的表达，结果表明高脂饮食诱导后小鼠中的肝组织中BTG2显著增加，并在脂肪肝发展过程中保持高水平(见图2)。如图所示：高脂饮食诱导后NAFLD组织中BTG2的表达在14、15、16周后逐渐升高，而正常对照组变化不明显。

图2 BTG2在高脂饮食诱导后的肝组织中表达升高

2.4经免疫组化验证NAFLD模型中BTG2表达量升高

我们将BTG2特异性抗体对模型组小鼠肝脏组织进行染色，并初步证实了在NAFLD组织不同细胞成分中BTG2蛋白表达增加(图3)。经过标记显示(图中红箭头所指)BTG2蛋白(黑色)明显要多于对照组，且实验组的脂肪组织出现了大量大小不等的脂肪空泡(蓝色箭头所指)。

图3免疫组化中，对照组与NAFLD组织中BTG2分子的表达

3、讨论

肥胖正迅速成为一个全球性问题，是肿瘤发生的重要危险因素[12],尤其是HCC,主要由于它与非酒精性脂肪性肝病密切相关[13]。大量证据支持肥胖与HCC之间存在风险关系[14,15]。实验表明，长期给小鼠喂食高脂肪食物会导致体内多余的脂质，使其产生NAFLD。已有研究证实，当多余的脂质不能再储存在脂肪组织中时，它们就被运送到周围组织，包括肝脏[16],从而导致外周组织脂质异位积聚等症状[17]。这些表现会增加体内葡萄糖水平，导致脂质代谢紊乱[18]。BTG2作为B细胞易位基因(BTG)/TOB家族成员，具有抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和导致细胞周期阻滞的功能。针对BTG2的机制及功能的验证主要集中在肿瘤细胞中[19,20]。BTG2是肝癌细胞中肥胖相关的直接靶点[21]。而BTG2在非肿瘤细胞中的作用如何，一些肝糖异生的研究中有所涉及但数量不多，研究证明BTG2具有保护线粒体功能[22],抵抗脂质积累[23]等。因此我们主要研究BTG2在脂质代谢异常中的表达情况。我们构建NAFLD模型小鼠来探讨BTG2的表达情况，高脂饮食喂养的小鼠体重和肝脏质量会明显升高，而且病理切片显示有明显的肝脂肪变性。随后通过qPCR检测BTG2的表达情况，发现14周以后BTG2在高脂饮食喂养的肥胖小鼠皮下脂肪组织中的表达也比正常饮食小鼠高，进一步暗示BTG2在肥胖和代谢性疾病中的脂质代谢作用。先前的一份报告指出：肝糖异生刺激剂的生长激素显著增加BTG2在脂肪细胞中的表达[10]。此外，在肿瘤细胞中，抑制作为肿瘤启动子的BTG2显著触发了与线粒体损伤相关的脂质积累、增殖和侵袭，在体外肥胖条件下，BTG2抑制的这些重要功能也得到了加强[21]。这表明BTG2在脂质代谢中发挥了重要的作用。同样，我们通过免疫组化验证BTG2蛋白在肝脏组织中的表达情况，发现高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝中BTG2蛋白表达升高，与qPCR结果相呼应。BTG2蛋白作为抵抗脂质积累的蛋白，在高脂饮食的小鼠模型中可以发现其表达量升高，这暗示BTG2的表达根据脂肪的积累而增加，从而发挥它的抑制作用。结合以上背景及实验结果我们推测BTG2表达的波动与脂肪细胞和脂肪组织分化过程中的脂肪代谢具有功能相关性。目前尚不清楚是什么驱动了BTG2在脂肪细胞中的动态表达模式，但这些基础条件可以为BTG2作为治疗NAFLD的靶点提供一定的理论支持。总之，我们的研究初步表明了BTG2在非酒精性脂肪肝过程中发挥了重要的作用，但具体机制需进一步研究。

基金资助:2022年度贵州省卫生健康委科学技术基金项目(项目编号:gzwkj2022-031);贵州省中医药管理局中医药､民族医药科技技术研究课题项目(编号:QZYY-2021-145); 2024年度贵州省卫生健康委科学技术基金项目(项目编号:gzwkj2024-002;gzwkj2024-013);

文章来源:宋美君,王旭,韦宁,等.BTG2在高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝中的表达及意义[J].贵州医药,2024,48(05):675-678+682.