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罗氟司特减轻肺炎链球菌肺炎大鼠的肺损伤

2024-09-29 8 上传者：管理员

摘要：目的探究罗氟司特对肺炎链球菌（SP）诱导的肺炎大鼠肺损伤的影响。方法将大鼠随机分为对照（control）组、肺炎模型（model）组、罗氟司特低和高剂量组以及罗氟司特高剂量+Colivelin组（STAT3激活剂）干预模型组。检测PaO2、PaCO2、IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α水平；肺组织湿/干比（W/D值）、MDA含量、MPO和SOD活性；HE染色观察肺组织病理损伤；检测肺组织细胞凋亡、cleaved caspase-3、IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达。结果与对照组相比，模型组大鼠肺组织有明显损伤；血液PaO2、氧合指数（OI）、肺组织IL-10水平、SOD活性显著降低，血液PaCO2水平、肺组织IL-1β、IL-8、TNF-α水平、W/D值、MDA含量、MPO活性、细胞凋亡率、cleaved caspase-3、IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白水平升高（P<0.05）。与模型组相比，罗氟司特低、高剂量组大鼠肺组织损伤显著减轻；血液PaO2、OI值、肺组织IL-10水平、SOD活性显著升高，血液PaCO2水平、肺组织IL-1β、IL-8、TNF-α水平、W/D值、MDA含量、MPO活性、细胞凋亡率、cleaved caspase-3、IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平显著降低（P<0.05）;Colivelin可部分逆转罗氟司特对SP肺炎大鼠肺损伤的改善作用（P<0.05）。结论罗氟司特可降低SP诱导的肺炎大鼠炎性反应、氧化损伤和细胞凋亡，改善肺功能。

关键词：
SP
罗氟司特
肺损伤
肺炎
肺炎链球菌
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肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)是一种革兰氏阳性致病菌，也是诱导肺炎的常见病原菌，肺部感染后，如治疗不及时会出现严重的炎性反应，进一步导致肺组织细胞大量死亡，出现肺功能障碍[1]。据世界卫生部门统计，全球每年有将近350万人死于SP感染肺炎，其中发展中国家尤为严重，已严重威胁人类生命安全。目前针对SP感染肺炎的治疗措施主要是使用抗生素类药物，但长期使用易产生耐药性，降低疗效[2]。因此开发新的药物对治疗SP感染肺炎具有重要意义。罗氟司特(roflumilast)是一种磷酸二酯酶选择性抑制剂，通过调节cAMP水平可阻断炎性反应信号传递[3]。研究表明罗氟司特可降低急性肺损伤大鼠炎性、氧化应激和细胞凋亡，改善肺组织损伤[3]。罗氟司特可降低急性肺损伤大鼠炎性反应和肺水肿[4]。罗氟司特对急性肺损伤有一定改善作用，但其作用机制尚不明确。IL-6是一种炎性因子，参与细胞多种生理代谢过程，IL-6与其受体结合后可激活其下游STAT3信号通路进而介导肺部炎性反应的发生[5]。抑制IL-6/STAT3信号通路可降低LPS诱导的急性肺损伤小鼠炎性反应，改善肺损伤[5]。本研究通过建立SP感染肺炎大鼠模型，观察罗氟司特干预对肺炎大鼠肺损伤的影响。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：

SPF级180～200 g雄性SD大鼠50只[上海砥石生物科技有限公司，许可证号SCXK(沪)2021-0003]。

1.1.2 主要试剂与仪器：

罗氟司特(Sigma-Aldrich公司);STAT3激活剂-Colivelin(MCE公司);IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α和ELISA试剂(深圳海思安生物技术有限公司);HE染色试剂盒(浙江羽翔生物科技有限公司);蛋白提取试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司);cleaved caspase-3、IL-6、p-STAT3、STAT3和β-actin一抗及二抗(Abcam公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：

将大鼠分为对照(control)组，肺炎模型(model)组(将10 μL含肺炎链球菌1×107CFU的菌悬液滴入大鼠鼻腔，每天1次，持续3 d)[6],罗氟司特低、高剂量干预模型组分别向模型大鼠静脉注射1和2 mg/kg的罗氟司特[7],罗氟司特高剂量+Colivelin干预模型组腹腔注射10 nmol/L的Colivelin[8],每组10只。对照组和模型组大鼠同方式给予等体积0.9%氯化钠注射液，1 d/次，持续7 d。治疗结束后，空腹8 h, 抽取大鼠主动脉血3 mL待测，取大鼠完整肺组织待测。

1.2.2 血气分析仪测定血液中氧合指数：

测定动脉血中氧分压(PaO2)和二氧化碳分压(PaCO2),并计算氧合指数(OI),OI=PaO2/FiO2。

1.2.3 ELISA检测肺组织炎性因子IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α水平：

取新鲜部分右肺组织冰浴研磨，制备组织匀浆，离心后取上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测相关指标。

1.2.4 称重检测肺组织湿/干比(W/D)和试剂盒检测肺组织中MDA含量、SOD和MPO活性：

冲洗大鼠左肺组织，并吸干表面多余水分，称的质量记录为湿重W,将其置于80 ℃烘箱中干燥至恒重，称的质量记录为干重D,计算W/D比。低温研磨部分大鼠右肺上叶组织，4 000 r/min离心10 min, 取上清按照试剂盒说明书检测MDA含量、SOD和MPO活性。

1.2.5 HE染色检测肺组织病理学变化：

用4%多聚甲醛固定大鼠右肺组织、脱水、透明、石蜡包埋、切片，HE染色，观察肺组织的病理形态，参照文献[9]对肺组织病理进行评分。

1.2.6 TUNEL染色检测肺组织细胞凋亡：

取上述固定肺组织，经脱水、石蜡包埋后切片，根据TUNEL试剂盒说明书操作步骤检测细胞凋亡，凋亡率=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.7 Western blot检测肺组织中cleaved caspase-3、IL-6、STAT3蛋白表达：

冰浴研磨右肺组织至匀浆，提取总蛋白，热水浴将蛋白变性，电泳分离并转移至PVDF膜上，封闭液中封闭2 h, 加入cleaved caspase-3、IL-6、p-STAT3、STAT3、β-actin一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗孵育，ECL显色，Image J软件分析蛋白表达。

1.3 统计学分析

Graphpad Prism 8.0.1分析计量数；数据以均值±标准差

表示；多组间比较用单因素方差分析；SNK-q检验组内两两差异。

2、结果

2.1 罗氟司特对肺功能的影响

模型组相较于对照组大鼠PaO2、OI水平显著降低，PaCO2水平显著升高(P<0.05);与模型组相比，罗氟司特低、高剂量组大鼠PaO2、 OI水平显著升高，PaCO2水平显著降低(P<0.05);与罗氟司特高剂量组相比，罗氟司特高剂量+Colivelin组大鼠PaO2、OI水平显著降低，PaCO2水平显著升高(P<0.05)(表1)。

表1 罗氟司特对各组大鼠肺功能的影响

2.2 罗氟司特对肺组织IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α水平的影响

模型组相较于对照组大鼠肺组织IL-1β、IL-8、TNF-α水平显著升高，IL-10水平显著降低(P<0.05);与模型组相比，罗氟司特低、高剂量组大鼠肺组织IL-1β、IL-8、TNF-α水平显著降低，IL-10水平显著升高(P<0.05);与罗氟司特高剂量组相比，罗氟司特高剂量+Colivelin组大鼠肺组织IL-1β、IL-8、TNF-α水平显著升高，IL-10水平显著降低(P<0.05)(表2)。

2.3 罗氟司特对大鼠肺组织W/D、MDA含量、SOD和MPO活性的影响

模型组大鼠肺组织W/D值、MDA含量和MPO活性显著高于对照组， SOD活性显著低于control组(P<0.05);与模型组相比，罗氟司特低、高剂量组大鼠肺组织W/D值和MDA含量和MPO活性显著降低，SOD活性显著升高(P<0.05);与罗氟司特高剂量组相比，罗氟司特高剂量+Colivelin组大鼠肺组织W/D值、MDA含量和MPO活性显著升高，SOD活性显著降低(P<0.05)(表3)。

表2 罗氟司特对肺组织IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α水平的影响

2.4 罗氟司特对肺组织形态变化的影响

对照组肺组织无明显损伤；模型组大鼠肺组织细胞排列杂乱，肺泡间隔和细支气管壁明显增厚，大量炎性细胞浸润，肺泡壁毛细血管明显扩张；与模型组相比，罗氟司特低、高剂量组大鼠肺组织形态有所改善；与罗氟司特高剂量组相比，罗氟司特高剂量+Colivelin组大鼠肺组织损伤明显加重。模型组大鼠肺组织病理评分(4.50±0.58)显著高于对照组(0.30±0.04)(P<0.05);罗氟司特低、高剂量组大鼠肺组织病理评分(3.40±0.37,1.40±0.16)显著低于模型组(4.50±0.58)(P<0.05);罗氟司特高剂量+Colivelin组大鼠肺组织病理评分(3.70±0.42)显著高于罗氟司特高剂量组(1.40±0.16)(P<0.05)(图1)。

2.5 罗氟司特对肺组织细胞凋亡的影响

模型组相较于对照组大鼠肺组织细胞凋亡率显著升高(P<0.05);与模型组相比，罗氟司特低、高剂量组组大鼠肺组织细胞凋亡率显著降低(P<0.05);与罗氟司特高剂量组相比，罗氟司特高剂量+Colivelin组大鼠肺组织细胞凋亡率显著升高(P<0.05)(图2,3)。

表3 罗氟司特对大鼠肺组织W/D比、MDA含量、SOD和MPO活性的影响

图1 HE染色观察大鼠肺组织形态变化

图2 TUNEL染色检测肺组织细胞凋亡

图3 罗氟司特对大鼠肺组织细胞凋亡的影响

2.6 罗氟司特对大鼠肺组织中相关蛋白表达的影响

模型组大鼠肺组织cleaved caspase-3、IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平高于对照组(P<0.05);与模型组相比，罗氟司特低、高剂量组大鼠上述指标显著降低(P<0.05);与罗氟司特高剂量组相比，罗氟司特高剂量+Colivelin组大鼠上述指标显著升高(P<0.05)(图4,5)。

图4 各组大鼠肺组织中cleaved caspase-3、IL-6、p-STAT3、STAT3蛋白表达

图5 罗氟司特对大鼠肺组织中相关蛋白表达的影响

3、讨论

SP是一种定植于上呼吸道可引发肺炎的致病菌。肺炎发生群体主要是婴幼儿、免疫力低下的病人和老年人，其具有传播特性，可引发区域流行[11]。患者感染SP后会促进肺组织炎性和氧化应激，引起肺功能下降，严重者导致死亡[11]。本研究结果显示，SP引起大鼠肺组织炎性反应和氧化应激，造成肺组织细胞凋亡和肺组织损伤，引发肺功能障碍。提示造模成功。罗氟司特是一种治疗慢性肺病的药物，具有降低炎性的药效[12]。有研究表明罗氟司特可降低高氧诱导的急性肺损伤大鼠炎性和肺水肿，减轻肺组织损伤[12]。罗氟司特可减轻重金属镉诱导的大鼠肝和睾丸炎性和氧化应激[13]。本研究结果显示，罗氟司特可降低SP诱导的肺炎大鼠炎性因子释放、氧化损伤、肺组织细胞凋亡，减轻肺组织损伤，改善肺功能，与上述研究结果一致。

IL-6为促炎细胞因子，也是多效性细胞因子，当感染发生时，机体中炎性细胞可形成大量IL-6,IL-6进一步与细胞膜上的gp130蛋白相互作用，激活STAT3使其磷酸化，活化的STAT3可进一步活化特异性转移因子，加速感染的发生发展[14]。有研究显示抑制IL-6/STAT3信号通路可降低甲氨蝶呤诱导的大鼠肺/肠组织炎性和氧化应激，降低组织损伤[14]。抑制IL-6/STAT3信号通路降低心力衰竭小鼠炎性和氧化应激，并促进心肌组织重塑[15]。本研究结果显示，model组大鼠IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平显著升高，IL-6/STAT3信号通路可能被激活。IL-6/STAT3信号通路干预后可降低IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达，抑制IL-6/STAT3信号通路。为进一步验证罗氟司特的作用靶点是IL-6/STAT3通路，本研究在罗氟司特干预基础上用STAT3激活剂Colivelin进行干预，结果显示，Colivelin可减弱罗氟司特对SP感染肺炎大鼠的改善作用。综合以上结果得出结论，罗氟司特通过抑制IL-6/STAT3信号通路可减低SP感染肺炎大鼠肺损伤。

综上所述，罗氟司特可降低SP诱导的肺炎大鼠炎性、氧化损伤和细胞凋亡，改善肺功能。罗氟司特对SP诱导的肺炎大鼠改善作用的具体机制还需进一步研究。

参考文献:

[1]刘青,张蕾,张利元,等.Circ_0038467靶向miR-182调控肺炎链球菌(Sp)诱导的人肺泡上皮细胞系HPAEpiC损伤[J].基础医学与临床,2021,41:1277-1284.

[6]王艺颖,简鼎,朱琳,等.Notch1在新生期小鼠肺炎链球菌感染诱导Th1/Th2失衡[J].陆军军医大学学报,2022,44:2138-2145.

基金资助:自贡市科技计划项目(2021ZC);

文章来源:黄黎芳,李艳钰,蔺曜,等.罗氟司特减轻肺炎链球菌肺炎大鼠的肺损伤[J].基础医学与临床,2024,44(10):1400-1406.