首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 呼吸内科论文 > miR-17通过调控自噬影响TGF-β1诱导的肺纤维化

miR-17通过调控自噬影响TGF-β1诱导的肺纤维化

2024-08-15 105 上传者：管理员

摘要：目的探讨miR-17对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的体外肺纤维化细胞模型自噬和纤维化的影响机制。方法重组人TGF-β1蛋白诱导人胚肺成纤维细胞HFL1,构建肺纤维化细胞模型，CCK-8检测细胞活力，ELISA试剂盒检测细胞上清中羟脯氨酸(Hyp)含量，鉴定造模成功与否。将细胞分成对照组、模型组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、miR-17 inhibitor组和miR-17 inhibitor+3-MA组。CCK-8检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot检测线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、p62和纤维化标志物α-SMA、CollagenⅠ蛋白的表达。结果 TGF-β1诱导后HFL1细胞活力升高(P<0.01),细胞上清中Hyp含量升高(P<0.01),体外肺纤维化细胞模型构建成功。与对照组相比，模型组细胞活力显著升高(P<0.01),细胞凋亡率显著降低(P<0.01),细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著降低(P<0.01),p62、α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达水平显著升高(均P<0.01);与模型组相比，miR-17 inhibitor组细胞活力显著降低(P<0.01),细胞凋亡率显著升高(P<0.01),细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P<0.01),p62、α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达水平显著降低(均P<0.01);与3-MA组相比，miR-17 inhibitor+3-MA组细胞活力显著降低(P<0.01),细胞凋亡率显著升高(P<0.01),细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P<0.01),p62、α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达水平显著降低(均P<0.01)。结论抑制miR-17可通过激活自噬抑制TGF-β1诱导的肺纤维化。

关键词：
ARDS
miR-17
呼吸衰竭疾病
急性呼吸窘迫综合征
肺纤维化
加入收藏

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是一种以严重肺部炎症、低氧血症和肺水肿为特征的呼吸衰竭疾病[1]。肺纤维化是ARDS预后不良的主要原因[2]。最近的研究表明，肺纤维增生开始于ARDS早期且肺纤维化程度与ARDS临床预后有关[3]。ARDS肺纤维化的病理生理过程复杂，其发病机制目前尚未完全阐明，且尚无药物能有效改善预后[4]。因此，明确ARDS肺纤维化的机制，对于其临床治疗具有重要意义。

miRNA参与多种病理生理过程和疾病的调节。研究表明，miR-17在大鼠纤维化肺组织中高表达[5],提示miR-17可能在肺纤维化进展中发挥重要作用，但其机制仍不清楚。自噬是细胞器和蛋白质自我降解的过程，在细胞分化、生存和稳态维持中起着重要作用。越来越多的研究表明，自噬在许多病理生理过程中也起着重要作用，如癌症、感染、心脏病和急性肺损伤等[6]。研究表明，激活自噬可抑制ARDS引起的肺纤维化进展[7],而miR-17可通过调控自噬影响肺癌和急性肺损伤等多种肺部疾病的进展[8-9],但miR-17在肺纤维化中的作用是否与自噬有关尚不清楚。因此，本研究通过构建体外肺纤维化细胞模型，探讨miR-17通过调节自噬影响肺纤维化的机制，为ARDS肺纤维化的治疗提供新的研究方向。

1、材料与方法

1.1 实验细胞与主要试剂

人胚肺成纤维细胞HFL1(货号：CL-0106)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。HFL1细胞专用培养液(货号：iCell-h017-001b)购自上海赛百慷生物技术股份有限公司，重组人TGF-β1蛋白(货号：100-21)购自美国PeproTech公司，3-甲基腺嘌呤(3-MA)(货号：M129496)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，LipofectamineTM2000转染试剂盒(货号：13778030)购自美国Invitrogen公司，AnnexinⅤ-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒(货号：P-CA-208)购自武汉普诺赛生命科技有限公司，CCK-8试剂盒(货号：BCCK0500)、人羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)ELISA试剂盒(货号：HM11025)、LC3-Ⅱ抗体(货号：PAB47947)、p62抗体(货号：PAB46078)、α-SMA抗体(货号：PAB30319)、CollagenⅠ抗体(货号：PAB46098)、GAPDH抗体(货号：PAB45851)和HRP标记的山羊抗兔IgG(货号：SAB43714)购自武汉Bioswamp公司。

1.2 细胞培养及肺纤维化细胞模型构建

HFL1细胞用HFL1细胞专用培养液培养，培养条件为37℃、5%CO2。取生长状态良好的HFL1细胞，用10 ng/mL的重组人TGF-β1蛋白诱导24 h, 构建肺纤维化细胞模型[10-11],并采用CCK-8法检测细胞活力，ELISA试剂盒检测细胞上清中的Hyp含量，鉴定造模成功与否。

1.3 细胞转染

按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明分别将miR-17 inhibitor/NC转染至TGF-β1诱导的HFL1细胞中，转染完成后在荧光显微镜下拍照，并通过qRT-PCR检测细胞中miR-17的表达，验证转染效率。

1.4 细胞分组

将HFL1细胞分成对照组、模型组、3-MA组、miR-17 inhibitor组和miR-17 inhibitor+3-MA组。对照组HFL1细胞正常培养；其余组细胞均用10 ng/mL的重组人TGF-β1蛋白诱导24 h, 诱导结束后，3-MA组细胞再用5 mmol/L的3-MA处理24 h[12],miR-17 inhibitor组转染miR-17 inhibitor, miR-17 inhibitor+3-MA组先用5 mmol/L的3-MA预处理1 h, 再转染miR-17 inhibitor。取对数生长期的各组细胞进行后续检测。

1.5 CCK-8检测细胞活性

将HFL1细胞接种至96孔板，培养24 h, 按照不同分组处理细胞，培养24 h后加入CCK-8溶液，培养4 h后使用酶标仪检测450 nm处的吸光度(A)值。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

收集各组细胞，加入预冷的PBS溶液洗涤，用500 μL稀释的1×Annexin Ⅴ binding buffer重悬细胞，加入5 μL的Annexin Ⅴ-APC染色液和5 μL的7-AAD染色液，4℃避光孵育20 min, 随即进行流式细胞学检测。

1.7 Western blot检测自噬相关蛋白和纤维化标志物的表达

收集各组对数生长期的细胞，加入RIPA裂解液，提取细胞总蛋白，并测定蛋白浓度。沸水浴使蛋白变性，取20 μg蛋白上样行SDS-PAGE电泳分离蛋白，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，分别加入一抗LC3-Ⅱ抗体、p62抗体、α-SMA抗体、CollagenⅠ抗体和GAPDH抗体(稀释比均为1∶1000),4℃孵育过夜，加入二抗(稀释比为1∶20000),室温孵育1 h, 洗膜3次后加入ECL发光液，置于全自动化学发光分析仪中检测。采用Image J软件分析条带灰度值。

1.8 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。结果以平均值±标准差

表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 细胞模型鉴定

CCK-8检测结果显示，TGF-β1诱导后HFL1细胞活力明显升高(P<0.01);ELISA检测结果显示，TGF-β1诱导后HFL1细胞中Hyp水平明显升高(P<0.01),表明肺纤维化细胞模型构建成功。见图1。

2.2 转染效率鉴定

荧光拍照结果显示，miR-17 NC组和miR-17 inhibitor组细胞均表达绿色荧光蛋白(GFP),表明miR-17 NC和miR-17 inhibitor均成功转染至HFL1细胞中。qRT-PCR检测结果显示，转染miR-17 inhibitor可显著降低HFL1细胞中miR-17的表达水平(P<0.01),表明miR-17 inhibitor转染成功。见图2。

图1细胞模型鉴定

图2转染效率鉴定

2.3 miR-17抑制对TGF-β1诱导的体外肺纤维化模型细胞活力的影响

CCK-8检测结果显示，与对照组相比，模型组细胞活力显著升高(P<0.01);与模型组相比，3-MA组细胞活力显著升高(P<0.05),miR-17 inhibitor组细胞活力显著降低(P<0.01);与3-MA组相比，miR-17 inhibitor+3-MA组细胞活力显著降低(P<0.01)。见图3。

2.4 miR-17抑制对TGF-β1诱导的体外肺纤维化模型细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，TGF-β1诱导后HFL1细胞凋亡率显著降低(P<0.01);与模型组相比，3-MA组细胞凋亡率显著降低(P<0.01),miR-17 inhibitor组细胞凋亡率显著升高(P<0.01);与3-MA组相比，miR-17 inhibitor+3-MA组细胞凋亡率显著升高(P<0.01)。见图4。

图3各组细胞活力比较

图4各组细胞凋亡率的比较

2.5 miR-17抑制对TGF-β1诱导的体外肺纤维化模型细胞自噬的影响

Western blot检测结果显示，与对照组相比，模型组细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著降低(P<0.01),p62蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组相比，3-MA组细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著降低(P<0.01),p62蛋白表达水平显著升高(P<0.01),miR-17 inhibitor组细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P<0.01),p62蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与3-MA组相比，miR-17 inhibitor+3-MA组细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P<0.01),p62蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。见图5。

图5各组细胞中LC3-Ⅱ和p62蛋白表达水平的比较

2.6 miR-17抑制对TGF-β1诱导的体外肺纤维化模型细胞中α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，与对照组相比，模型组细胞中α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达水平显著升高(均P<0.01);与模型组相比，3-MA组细胞中α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达水平升高，但差异没有统计学意义(均P>0.05),miR-17 inhibitor组细胞中α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达水平显著降低(均P<0.01);与3-MA组相比，miR-17 inhibitor+3-MA组细胞中α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达水平显著降低(均P<0.01)。见图6。

图6各组细胞中α-SMA和collagenⅠ蛋白表达水平的比较

3、讨论

ARDS具有较高的病死率，且目前尚没有明确有效的治疗策略。在ARDS患者中，肺组织纤维化的早期发展与预后不良相关[13]。因此，通过对早期肺纤维化的研究，寻找更有效的ARDS治疗方案至关重要。

活化的TGF-β是纤维化反应的关键。研究证明TGF-β可以在邻近的肺上皮细胞中触发相关信号，TGF-β信号通路的激活导致促纤维化调节因子的转录，进而导致上皮细胞死亡，促进纤维增生反应[14]。随着对肺纤维化发病机制认识的加深，TGF-β1被发现是纤维化过程中主要的促纤维化生长因子，调控细胞增殖、分化和凋亡。TGF-β1过表达导致胶原沉积，诱发多发性纤维化疾病[15]。因此，本研究使用TGF-β1诱导成纤维细胞构建体外肺纤维化模型。Hyp是胶原中特有的氨基酸，是胶原组织的主要成分之一。有数据证实，Hyp可作为定量纤维化的可靠方法[16]。本研究结果显示，TGF-β1诱导后Hyp分泌增加，且细胞活力增强，表明体外肺纤维化模型构建成功。

据报道，肺纤维化中存在多种异常表达的miRNA,如miR-29[17]、miR-155[18]、miR-761[19]和miR-21[20]等已被证实在肺纤维化中显著下调或上调。研究表明，miR-17在多种纤维化组织中异常表达。Yu等[21]发现miR-17-5p可通过激活Wnt/β-catenin通路，导致肝星状细胞活化，参与肝纤维化的进展。Fu等[22]发现miR-17下调可通过靶向Smad7抑制TGF-β1介导的肾纤维化。但miR-17在肺纤维化中的作用仍不明确。因此，为明确miR-17对肺纤维化的影响，本研究将miR-17 inhibitor转染至TGF-β1诱导的肺纤维化细胞模型中，结果显示，转染miR-17 inhibitor可抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖，并促进凋亡，提示miR-17在肺纤维化中发挥关键作用。

线粒体自噬是一种进化上高度保守的饥饿反应机制，在生物发育和机体稳态维持中起着重要作用。线粒体自噬参与多种疾病的病理过程，如神经退行性疾病、心脑血管疾病、肿瘤和肺损伤等，调节细胞自噬已成为预防和治疗这些疾病的重要策略[23-24]。此外，线粒体自噬异常与纤维化疾病也密切相关。线粒体自噬障碍可导致成纤维细胞增殖，这可能是ARDS肺纤维化发生发展的重要因素之一[7]。越来越多的证据表明miR-17参与多种疾病中自噬的调节。例如，Li等[9]发现在急性肺损伤中抑制miR-17-5p可诱导自噬。Shi等[25]发现下调miR-17-5p可通过靶向上调PTEN的表达来抑制甲状腺癌细胞的增殖和自噬，促进细胞凋亡。Wang等[26]发现miR-17-5p可通过调节HL-60细胞中的Beclin-1,促进增殖，抑制自噬和凋亡。在本研究中，转染miR-17 inhibitor可上调肺纤维化细胞模型中LC3-Ⅱ的表达，并下调p62的表达，提示抑制miR-17可以促进肺纤维化细胞的自噬。此外，我们还发现转染miR-17 inhibitor可下调肺纤维化细胞中纤维化标志物α-SMA和CollagenⅠ的表达，这表明miR-17 inhibitor可通过激活自噬影响肺纤维化。为明确其机制，我们用自噬抑制剂3-MA处理肺纤维化细胞，结果显示自噬抑制剂3-MA和miR-17 inhibitor作用相反，且与3-MA单独作用相比，联合转染miR-17 inhibitor可逆转3-MA对自噬的抑制作用和对肺纤维化的促进作用。以上这些结果表明miR-17 inhibitor可以通过激活自噬来减轻肺纤维化。

综上所述，抑制miR-17可通过激活自噬抑制TGF-β1诱导的肺纤维化，这一发现为miR-17抑制剂在ARDS治疗中的应用提供了重要的基础。后续还应深入研究miR-17调控肺纤维化线粒体自噬的靶点，进一步明确miR-17在肺纤维化进展中的作用机制。T

参考文献:

[6] 李秋呈,李琪,贾盼红,等.自噬在多种因素所致急性肺损伤中的研究进展[J].海南医学院学报,2022,28(15):1194-1200.

[12]黄彬,张军,郑金旭,等.circ_0007762通过miR-18a-5p调节肺成纤维细胞自噬的机制研究[J].天津医药,2022,50(6):571-578.

[24]许美霞,周贤,刘涛,等.Cyclin D1､P27在小鼠ARDS肺纤维化中的表达及意义[J].华中科技大学学报:医学版,2023,52(2):195-199.

基金资助:湖北省自然科学基金资助项目(No.2022CFB423,No.2023AFB1055);

文章来源:许美霞,安宁,张晓霞,等.miR-17通过调控自噬影响TGF-β1诱导的肺纤维化[J].华中科技大学学报(医学版),2024,53(04):473-478.