结核病(tuberculosis, TB)是严重威胁人类生命健康安全的公共卫生问题，由结核分枝杆菌感染引起。据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)报告，2021年全球新发结核病病例1 060万例，死亡病例140万例，是艾滋病致死人数(65万例)的2倍多[1]。政府每年需要投入大量的资金和人力来预防和治疗结核病，耐多药结核病的出现进一步加大了结核病防治难度。耐多药结核病患者治愈率低，需要更昂贵的药物及更长的治疗周期[2],有研究表明，患耐多药结核病或广泛耐药结核病的艾滋病患者病死率超过90%[3]。使用快速诊断技术及早发现并筛查出耐多药结核病患者，有利于医生及时采取干预措施，合理选择抗结核方案，以降低耐多药结核病的发生率。但就目前全球的情况来看，WHO推荐的快速分子诊断技术应用仍有限，2021年新诊断的患者中只有38%使用了快速分子诊断技术作为初次检测[1]。

分离培养及药敏试验是临床上广泛应用的结核分枝杆菌检测技术，具有极高的灵敏度和特异度，且价格低廉，是结核病诊断的“金标准”。但普通的罗氏培养及药敏试验的鉴定流程大致需要4～6周的时间，临床时效性差，可能会造成诊治延误。BACTEC MGIT960自动化快速培养系统，相比于固体培养，能够在进一步提高准确性的同时将检测周期缩短至1～2周。在结核分枝杆菌耐药检测中，与比例法药敏试验有较好的一致性。但相比于分子诊断技术，MGIT960技术仍需要较久的检测时间，污染率高也是该方法存在的缺陷。基因芯片技术又称DNA微阵列技术或DNA芯片技术，是快速分子诊断技术飞速发展的产物之一。基因芯片在固相载体上固定有大量官能化探针，通过和待测样本DNA序列或RNA序列杂交，能够获得待测样本的核苷酸序列信息，达到快速菌种鉴定的目的。结核分枝杆菌产生耐药的一个重要因素是基因突变，如rpoB、inhA、embB、rpsL/rrs突变分别与利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素耐药有关，通过基因芯片技术对相关耐药基因进行检测，就能够推断出结核分枝杆菌的耐药情况。

相较于传统分离培养，基因芯片技术的一大优势是“快”,能够在6h内完成检测流程。目前常规的基因芯片技术所使用的样本是经过分离培养后的结核分枝杆菌阳性菌株，仅仅缩短了药敏检测的时间。本研究通过收集疑似结核病患者的临床标本，包括痰液、肺泡灌洗液、脓液或分泌物、穿刺液(含胸腹水和脑脊液)等，对同一患者的同一份标本同时进行MGIT960培养鉴定和基因芯片检测，以MGIT960培养鉴定及耐药结果为参考标准，探究基因芯片直接检测临床原始样本的灵敏度、特异度及一致性。

1、资料和方法

1.1 样本来源

收集我院2022年10月—2023年10月疑似结核病患者共390例，其中男282例，女108例，年龄4～85岁，中位年龄51岁。

1.2 仪器和试剂

仪器：BACTEC MGIT 960 System培养仪(美国BD公司);E×tractor 36核酸快速提取仪(北京博奥晶典生物技术有限公司);LifeECO PCR扩增仪(杭州博日科技有限公司);晶芯微阵列芯片扫描仪Lu×ScanTM10K-B(北京博奥晶典生物技术有限公司)。试剂：BBL MGIT分枝杆菌生长指示培养管(美国BD公司);结核分枝杆菌抗原MPT64检测试剂盒(胶体金法，韩国雅培诊断股份有限公司);BACTEC MGIT 960 SIRE Kit药敏试剂盒(包括BACTEC MGIT SIRE药物和BACTEC MGIT SIRE添加剂，美国BD公司);HybSet基因微阵列芯片杂交盒(北京博奥晶典生物技术有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 BACTEC MGIT 960接种培养及药敏试验。

用于接种培养的样本根据不同类型进行相应处理。痰液/肺泡灌洗液/穿刺液样本：在样本中加入1～2倍4%NaOH,漩涡振荡15～20s, 室温静置15～20min后，加入无菌pH 6.8 PBS缓冲液温和混匀，离心后去上清，再加入 0.5～1mL PBS缓冲液以中和pH,混匀。脓液或分泌物：样本中加入1～3倍4%H2SO4,混匀，静置250min(其间进行数次振荡)。加入0.5mL营养添加剂与0.1mL杂菌抑制剂至BBL MGIT分枝杆菌生长指示培养管中，随后在培养管中接种0.5mL样本，培养方法严格按照 BACTEC MGIT 960系统操作说明书进行，培养时间设定为42d。取培养结果为结核分枝杆菌阳性的样本100μL,加至结核分枝杆菌抗原MPT64检测卡样本孔中，150min内判读结果。窗口中显示两条色带，表示检测到结核分枝杆菌。培养结果为结核分枝杆菌阳性的样本继续培养1～2d, 取0.1mL菌液至10mL生理盐水，做1∶100稀释，加入0.5mL稀释后的菌液至生长控制管中，另加入0.5mL未稀释的菌液至另四个加好100μL药物(分别是异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇)的试管，生长控制管和每一药物管再加入0.8mL BACTEC MGIT SIRE添加剂，按照程序将试管放入仪器。

1.3.2 基因芯片技术检测。

标本加入等量10%NaOH 溶液，振荡液化1 520min, 以3 035g离心5min, 离心后弃上清。再加入1mL生理盐水，充分振荡后以12 830g离心5min, 离心后弃上清。向核酸提取管中加入80μL核酸提取液，加入上述标本后，使用E×tractor 36 核酸快速提取仪振荡5min, 95℃水浴5min, 再以8 910g离心1min。核酸提取管中加入处理后的样本及80μL核酸提取液。将核酸提取管放入E×tractor36核酸快速提取仪振荡5min, 随后95℃水浴5min, 5 000r/min离心1min。在三个离心管中分别加入18μL PCR扩增试剂1、2、3,随后每管再加入模板DNA 2μL。按照说明书设定好PCR反应热循环程序进行核酸扩增。将芯片正面向上放在杂交盒托架上(杂交盒底部提前加入200μL蒸馏水),盖上盖片。每个被测样本准备2个离心管，每个离心管加入9μL加热融化后的杂交缓冲液和3μL PCR产物1,在其中一个离心管加入3μL PCR产物2,另一个离心管加入3μL PCR产物3,每个杂交反应混合物有15μL。将杂交反应混合物置于95℃环境中变性5min, 随后浸入冰水混合物中3min。3min后取出杂交反应混合物，混匀后取13.5μL加入基因芯片微阵列中。迅速盖上杂交盒、密封。将杂交盒置于50℃恒温水浴120min。取出芯片，进行芯片洗涤，先在芯片洗涤液Ⅰ中80～100r/min室温洗涤3min, 之后在芯片洗涤液Ⅱ中80～100r/min室温洗涤3min, 最后800r/min离心5min, 甩干后放进仪器进行芯片扫描和结果判读。

1.4 统计学方法

使用SPSS22.0统计软件进行分析。组间比较采用χ2检验，以MGIT960培养及药敏试验为标准，计算基因芯片技术的特异度、灵敏度、阳性预测值、阴性预测值、一致性。采用Kappa检验计算两种试验的一致性，Kappa值≥0.75表示两种方法一致性较好，0.75>Kappa值≥0.40表示两种方法一致性中等，Kappa值<0.40表示两种方法一致性较差。各百分率的95%CI采用OpenEpi3.01软件进行计算。

2、结果

2.1 菌种鉴定结果

本研究390例疑似结核样本中，MGIT960培养法检测出180例阳性，基因芯片直接法检测出165例阳性。两种方法均为阳性的标本有150例。以MGIT960培养鉴定结果为参考标准，基因芯片法的灵敏度为83.33%,特异度为92.86%,阳性预测值为90.91%,阴性预测值为86.67%,一致性为88.46%,Kappa值为0.766。见表1。

表1以MGIT960培养鉴定结果为参考标准判断基因芯片法检测结核分枝杆菌的效能

2.2 结核分枝杆菌利福平耐药检测结果

将150例MGIT960培养鉴定及基因芯片检测均为阳性的样本进行耐药检测，其中MGIT960使用的样本为培养阳性菌液，基因芯片法直接使用临床原始样本检测。以MGIT960药敏试验为标准，基因芯片法的灵敏度为81.82%,特异度为94.87%,阳性预测值为81.82%,阴性预测值为94.87%,一致性为92.00%、Kappa值为0.767。见表2。

表2以MGIT960培养及其药敏试验结果为参考标准判断基因芯片法检测利福平耐药性的效能

2.3 结核分枝杆菌异烟肼耐药检测结果

以MGIT960药敏试验为标准，基因芯片检测的灵敏度为75.00%,特异度为92.86%,阳性预测值为66.67%,阴性预测值为95.12%,一致性为90.00%,Kappa值为0.755。见表3。

表3以MGIT960培养及其药敏试验结果为参考标准判断基因芯片法检测异烟肼耐药性的效能

3、讨论

新型冠状病毒的流行对结核病的预防、检测和治疗造成了严重影响，2021年，结核病死亡人数及死亡率二十年来首次增加。与艾滋病的致命伙伴关系及耐药结核病的广泛传播，进一步加剧了结核病防控的挑战和难度[4]。彻底消除结核病是一个艰巨但是世界各国必须实现的目标，目前我们所达到的结核病防控成果距离WHO提出的“2035年将结核病发病率减少90%,死亡数减少95%”终止结核病目标仍有一段距离。世界各国要凝聚共识，加大决心和投入。一方面要加强结核病筛查和监控，完善结核病防治措施，规范结核病医疗质量。另一方面要加强相关治疗药物和诊断技术的研发工作，通过科技创新推动目标早日实现。加快推进快速分子诊断技术的应用，提高诊断准确率，缩短结核病诊断时间，是结核病防治的重点。目前市面上流行的快速分子诊断技术有Gene×pert MTB/RIF技术、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、线性探针分析(Line Probe Assays, LPA)、基因芯片技术等，但都存在一定缺陷，从而限制其广泛推广。例如最新一代的Gene×pertMTB/×DR技术能够在90min内对抗结核一线药物异烟肼及部分抗结核二线药物进行检测[5],但该方法所使用的仪器及试剂过于昂贵，大部分欠发达地区无法承受其高耗费[6]。LAMP技术简便、快捷，但无法检测结核分枝杆菌的耐药性[7]。LPA技术在结核分枝杆菌利福平、异烟肼和氟喹诺酮类等药物耐药性检测方面具有很高的灵敏度和特异度[8],但在涂片阴性标本中表现不太理想[9]。基因芯片技术作为新一代分子检测技术，克服了传统方法操作烦琐、检测效率低的缺陷，并结合了分子生物技术的高灵敏度和生物芯片高通量优势，在结核分枝杆菌检测方面逐渐得到推广应用。相关研究表明，基因芯片技术在肺结核[10]、淋巴结核[11]、矽肺合并分枝杆菌感染[12]等相关结核病诊断及药敏测定具有优良的检测性能，对各类结核病的早期诊断和治疗具有重要意义。

本研究以MGIT960培养为参考标准，对比基因芯片直接检测法进行结核分枝杆菌检测的灵敏度为83.33%,特异度为92.86%,Kappa检测结果为0.766,表示两种检测方法一致性较好；与MGIT960耐药试验在结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼检测方面相比，Kappa值均>0.750,两者一致性较好。基因芯片检测结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼的灵敏度、特异度分别为81.82%、94.87%和75.00%、92.86%,与陈蕾[13]的研究结果基本一致。陈蕾的研究中，基因芯片检测结核分枝杆菌耐利福平灵敏度和特异度为79.17%、97.54%,耐异烟肼灵敏度和特异度为75.41%、99.63%。本研究与后者研究结果中，基因芯片技术检测耐异烟肼灵敏度均低于耐利福平灵敏度，推测可能是因为导致结核分枝杆菌产生异烟肼耐药的机制比利福平更为复杂，除了本研究检测的KatG基因315位点AGC→ACC、AGC→AAC及inhA-15 位点C→T三个突变型外，还有其他基因突变如：fabG1、ahpC、kasA,以及KatG和inhA片段的其他碱基位点突变也可能导致结核分枝杆菌产生异烟肼耐药性。而96%的结核分枝杆菌对利福平耐药产生耐药性是由rpoB基因突变引起的[14]。在相关以结核分枝杆菌菌株为样本的研究中，高会霞等[15]发现基因芯片检测结核分枝杆菌耐利福平的灵敏度和特异度为96.1%和100%,检测耐异烟肼的灵敏度和特异度为90.8%和100%,高于本研究，而古丽娜·巴德尔汗等[16]的结果中基因芯片检测结核分枝杆菌耐利福平的灵敏度和特异度为80.00%和89.33%,检测耐异烟肼的灵敏度和特异度为77.08%和97.01%,与本研究结果相近，证明在菌量少且杂菌多的原始样本中，基因芯片技术同样能够表现出良好的检测性能，同时省去了结核分枝杆菌培养所需的长周期。此外也提示基因芯片技术的结核分枝杆菌耐药检测性能与样本含菌量有关。相关研究表明，基因芯片技术在不同抗酸染色阳性等级标本中拥有不同的表现。在阳性等级≥2+的标本中，基因芯片技术检测利福平和异烟肼耐药的灵敏度、阳性预测值、Kappa值均大于阳性等级≤1+的标本，且随着阳性等级增加，参数值随之增加[17]。

上述结果表明，基因芯片技术和MGIT960培养及药敏试验具有较好的一致性，灵敏度和特异度高，重要的是，基因芯片技术大幅缩短了结核分枝杆菌菌种鉴定及耐药检测流程时长，为临床快速诊断结核病、合理选择治疗方案提供有力依据。

本研究的局限性在于检测的结核分枝杆菌耐药基因位点有限，若能够增加基因芯片技术的检测范围，对异烟肼的其他耐药基因位点(如fabG1、ahpC、kasA)进行检测，药敏试验结果的准确性能够进一步提高。在耐药检测方面，由于基因芯片技术只能检测结核分枝杆菌的相关耐药基因情况，可能会忽略细菌的固有耐药机制，例如药物外排泵、细胞壁渗透性降低、细胞代谢等[14],这些导致结核分枝杆菌产生耐药的机制都不是通过基因突变引起的，在这些情况下进行基因芯片检测可能造成假阴性结果。

综上所述，应用基因芯片技术直接检测临床样本，无须经过细菌培养、刮取菌落提取核酸的步骤，比常规基因芯片技术更加快捷高效。相比于传统结核培养与药敏试验，基因芯片技术直接检测临床样本准确、快速、灵敏，对于结核病早期诊断、耐药结核病筛查具有重要意义，值得在临床中广泛推广。

参考文献:

[10]唐再庆,唐明昊,朱晓琳,等.基因芯片技术在肺结核快速诊断及分枝杆菌菌种鉴定中的应用价值[J].结核病与肺部健康杂志,2020,9(1):55-57.

[11]曾忠,周静,陶俊,等.应用基因芯片技术诊断淋巴结核及其耐药性分析[J].中华临床医师杂志(电子版),2020,14(11):890-894.

[12]黄鸿波,许小婷,庄锡彬,等.基因芯片技术在矽肺合并分枝杆菌感染诊治中的应用[J].环境与职业医学,2022,39(9):1021-1025.

[13]陈蕾.基因芯片法在肺结核诊断中的临床应用价值[J].临床肺科杂志,2017,22(10):1879-1883.

[14]丁磊,徐俊驰,邱文娜,等.结核分枝杆菌耐药机制和治疗的最新研究进展[J].现代检验医学杂志,2021,36(2):1-5.

[15]高会霞,冯爱东,柳晓金,等.基因芯片技术诊断耐多药结核病的临床应用研究[J].天津医药,2016,44(9):1155-1159.

[16]古丽娜·巴德尔汗,李远春,阿依努尔·莫合买提,等.DNA-微阵列芯片检测技术与Gene-Xpert MTB/RIF技术在新疆维吾尔自治区结核分枝杆菌耐药性诊断中的应用[J].检验医学与临床,2020,17(21):3113-3118.

文章来源:林正龙,张蓓英.基因芯片技术快速检测结核分枝杆菌耐药基因的应用价值研究[J].医学理论与实践,2024,37(17):2893-2896.