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结核分枝杆菌MazF5毒素蛋白的生物信息学分析

2024-08-02 59 上传者：管理员

摘要：目的探究结核分枝杆菌MazF5蛋白的结构与功能。方法从NCBI数据库获得编码MazF5基因信息及氨基酸的序列；运用Expasy的ProtParam应用插件分析蛋白理化性质；运用ProtScale、SignalP 4.1、TMHMM Serverv.2.0、NetPhos 3.1、YinOYang 1.2软件分别预测蛋白的亲疏水性、信号肽、跨膜区、磷酸化位点及糖基化位点；运用SOMPA、SWISS-MODEL软件分别预测蛋白的二级和三级结构；运用DoGSiteScorer软件预测蛋白的小分子结合口袋；运用STRING数据库分析MazF5互作蛋白；运用BioEdit软件分析氨基酸序列同源性；运用ABCpred和SYFPEITHI对蛋白的B、Th、CTL细胞抗原表位进行预测。结果 MazF5蛋白分子式为C510H866N158O149S7,所含原子数为1 690,由109个氨基酸组成。预测的等电点PI为9.00,半衰期为30 h,脂溶性指数是113.58,不稳定指数为51.82,为不稳定蛋白。此外，MazF5蛋白无信号肽、为非跨膜蛋白、拥有多个磷酸化及糖基化位点，二级结构中无规则卷曲含量最多。同时，它含有多个小分子结合区域，并能与MazE5、MazF3、MazF6、MazF9等多个蛋白相互作用。氨基酸序列同源性分析结果显示结核分枝杆菌与卡内特分枝杆菌同源性较高。MazF5蛋白还具有多个B、T细胞优势抗原表位。结论 MazF5蛋白存在多个位点和抗原表位，存在蛋白相互作用网络，具有多个小分子结合位点，是潜在的结核病检测血清标志物。

关键词：
MazF5
毒素蛋白
生物信息学
结核分枝杆菌
结核病
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结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的最致命的传染病之一，是一个重大的公共卫生问题。全球约四分之一人口潜伏感染结核分枝杆菌[1],约3.4%、18.0%的结核病新发病例和复发病例耐多药(MDR)或利福平耐药[2]。Mtb主要通过脂质、荚膜和蛋白质来发挥致病作用[3],其游离的毒素蛋白能抑制细菌生长繁殖，使细菌形成休眠体或进入持留状态，有利于应激或抗生素条件下的存活。结核分枝杆菌Ⅱ型毒素-抗毒素系统(TA)的MazEF家族一直备受关注，它与细菌应激反应和对抗生素耐受有关。迄今为止，大多数MazEF系统的结构及其在Mtb的功能尚不清楚。MazF5是MazEF的一种毒素蛋白，在广泛耐药的Mtb临床分离株的转录组学分析中MazF5高度上调。因此，本文通过生物信息学方法预测了MazF5蛋白结构和功能，为解释Mtb耐药机制及药物研发提供理论依据，对认识及揭示结核分枝杆菌的持留及致病机制有着深远的意义。

1、材料与方法

1基因来源及有关编码信息

从NCBI数据库获取结核分枝杆菌(H37Rv)的基因组信息，登录号为NC_000962.3。其中，Rv1942c(Gene ID:885606)位于全基因组的2194644-2194973区域，基因全长330 bp。该基因所编码蛋白质MazF5在蛋白质库中的登录号为NP_216458.1。

2蛋白生物信息学分析

2.1 MazF5蛋白基本理化性质

运用Expasy的ProtParam应用插件分析蛋白的理化性质。

2.2 MazF5蛋白亲疏水性、信号肽、跨膜区、磷酸化及糖基化位点

运用ProtScale、SignalP 4.1、TMHMM Serverv.2.0、NetPhos 3.1、YinOYang 1.2及NetNGlyc 1.0软件分别预测蛋白的亲疏水性、信号肽、跨膜区、磷酸化位点及糖基化位点。

2.3 MazF5蛋白二级和三级结构

运用SOMPA预测蛋白的二级结构，SWISS-MODEL软件构建三级结构模型同时用SAVES v6.0对模型进行评估。

2.4 MazF5蛋白小分子结合口袋

运用DoGSiteScorer在线工具虚拟筛选与蛋白结合的小分子结合区，结果通过Chimera软件呈现。

2.5 MazF5相互作用蛋白及氨基酸序列同源性分析

运用STRING数据库预测MazF5互作蛋白，通过NCBI网站对各菌株MazF5氨基酸序列进行比对，并用BioEdit软件分析同源性。

2.6 MazF5蛋白抗原表位

运用ABCpred和SYFPEITHI软件对蛋白B细胞、Th细胞及CTL细胞抗原表位预测。

2、结果

1 MazF5蛋白基本理化性质

MazF5蛋白分子式为C510H866N158O149S7,分子质量为11 819.88,(包含)原子数为1 690,等电点PI为9.00,带正、负电荷残基数分别为15、12。MazF5由109个氨基酸组成，其中丙氨酸(12.8%)、精氨酸(13.8%)、亮氨酸(10.1%)、缬氨酸(13.8%)所占比例较高。预测该蛋白的半衰期为30 h,脂溶性指数是113.58,不稳定指数为51.82,可能为不稳定蛋白。

2 MazF5蛋白亲疏水性、信号肽、跨膜区、磷酸化及糖基化位点

ProtScale预测结果显示最大亲水性值为2.067,最小亲水性值为-1.556,总平均亲水性为0.287,预测该蛋白为疏水蛋白(图1A)。信号肽预测软件SignalP 4.1结果显示D值为0.177,未能超过阈值0.450,提示该蛋白无信号肽可能不是分泌蛋白(图1B)。TMHMM分析MazF5跨膜螺旋数量为0,不存在跨膜螺旋，无跨膜区。磷酸化位点结果显示该蛋白有11个可能的磷酸化位点，其中丝氨酸的磷酸化位点有8个，苏氨酸的磷酸化位点有3个(图1C)。YinOYang 1.2预测O-糖基化位点有13个(图1D),NetNGlyc 1.0预测蛋白无N-糖基化位点。

图1 MazF5亲疏水性、信号肽、磷酸化及糖基化位点

Fig.1 Analysis of MazF5 hydrophilicity, signal peptide, phosphorylation and glycosylation sites

3 MazF5蛋白二级和三级结构

SOMPA预测MazF5蛋白二级结构包括无规则卷曲(Cc)45个，含量占41.28%;α-螺旋(Hh)35个，含量占32.11%;伸展链(Ee)23个，占21.10%;β-折角(Tt)6个，含量占5.50%。运用SWISS MODEL软件以A0A370D668.1.A为模板，AlphaFold v2方法对MazF5蛋白同源建模(图2A),该模型GMQE指数为0.95。采用SAVES v6.0进行模型评估，拉氏图显示(图2B),95.8%氨基酸位点位于最大允许区(红色区域),3.2%氨基酸位点位于允许区(黄色区域),1.1%氨基酸位点位于不允许区(白色区域),表明所构三级结构模型准确度高。

图2 MazF5蛋白三级结构模型预测及质量评估

4 MazF5蛋白小分子结合口袋

以建模的MazF蛋白质三级结构为基础，DoGSiteScorer共预测MazF5蛋白有5个结合口袋，选取前3个小分子结合区域，然后通过Chimera软件作图展现(图3A),其各自的几何信息如下(图3B)。

图3 MazF5蛋白小分子结合口袋预测

5 MazF5相互作用蛋白及氨基酸序列同源性

STRING在线数据库显示MazF5存在10个相互作用蛋白(图4A),与预测的互作蛋白相关性分别为0.957(MazE5)、0.881(MazF9)、0.854(MazF1)、0.851(MazF3)、0.803(MazE9)、0.802(Rv1944c)、0.705(relE)、0.674(MazF6)、0.656(MazE6)、0.648(relF)。通过NCBI网站将已知结核分枝杆菌MazF5蛋白氨基酸序列与临床常见非结核分枝杆菌例卡内特分枝杆菌(Mycobacterium canettii)、堪萨斯分枝杆菌(M.pseudokansasi)、胃分枝杆菌(M.gastri)、亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)、森冈分枝杆菌(M.moriokaense)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)的氨基酸序列进行比对，利用BioEdit软件分析同源性(图4B)。结果显示结核分枝杆菌MazF5蛋白与卡内特分枝杆菌的同源性较高。

图4 MazF5相互作用蛋白及氨基酸序列同源性

图5 MazF5蛋白的作用

6 MazF5蛋白抗原表位

利用ABCpred软件预测MazF5蛋白B细胞抗原表位，SYFPEITHI软件预测Th细胞和CTL细胞抗原表位，结果显示B细胞优势抗原表位得分>0.5的有12个(表1),Th细胞优势抗原表位得分>20的有18个(表2),CTL细胞优势抗原表位得分>20的有8个(表3)。

表1 MazF5蛋白B细胞优势抗原表位预测

3、讨论

结核病是一种高度传染性的疾病，是全球死亡的主要原因之一。潜伏性结核感染不表现临床症状但仍具有传染性，临床上不易被发现控制，被认为是根除结核病的关键障碍[4]。耐药结核是当前全球重要的公共卫生问题，也是我国亟待解决的难题。我国肺结核患者对多种药物产生耐药性的概率已经>8%。长期的潜伏感染和广泛使用抗结核药物为结核病的诊断和治疗带来了严重挑战[5]。

表2 MazF5蛋白Th细胞优势抗原表位预测

表3 MazF5蛋白CTL细胞优势抗原表位预测

毒素-抗毒素系统(TA)在原核生物中广泛存在，它包括6种类型。其中，Ⅱ型TA系统是数量最多的，通常由两个基因组成，它们位于同一个操纵子中，基因序列连续且存在部分碱基的重叠。上游基因编码抗毒素蛋白，下游基因编码毒素蛋白。当在Mtb氧化应激、缺氧等压力应激条件时，不稳定的抗毒素迅速地发生降解，有活性的毒素蛋白就被释放出来影响细胞分裂等功能。应激状态或抗生素存在条件下，释放的游离活性毒素参与调控Mtb使其处于休眠状态[6],并干扰宿主细胞功能[7]。Mtb躲避宿主的免疫系统在宿主细胞内保持休眠与TA系统在Mtb的较大数量存在密切的联系[8]。单独敲除Mtb中的任何一个MazF家族成员基因，均能够不同程度地减弱耐药持留菌的形成。因此，MazEF家族与Mtb在应对抗菌药物压力时的持留性及其耐药的形成之间存在相关性。

Mtb具有表型多样性，这种特性使其在感染期间遭遇恶劣条件下生存，通过进入不同的生理状态避免免疫杀伤。Srinivas等[9]曾发现休眠菌的产生与MazF过表达有关。在多重耐药的菌株中有MazE5的表达含量明显下降MazF5蛋白表达相对增加的现象[10]。目前，临床对于Mtb诊断方法不敏感，需要探寻新的毒力决定因素解决这一困难[11]。外泌体是参与细胞间通讯和免疫调节的重要载体，它释放到细胞外环境后可以被不同种类的细胞所吸收[12]。Rv1942c作为可以编码MazF5蛋白的基因能够在Mtb感染巨噬细胞来源的外泌体中检测到，对结核病诊断也有很大潜力。Zhang等[13]对MazEF高表达的耻垢分枝杆菌转录分析时发现参与铁调节、获取、转运、储存的基因也同时表达上调，高表达MazF5的结核菌株其铁代谢能力增强。Mtb主要感染巨噬细胞和树突状细胞[14],在大多数正常个体中，适应性免疫反应主要通过T细胞控制Mtb的生长，并分泌IFN-γ和TNF-α等细胞因子促进巨噬细胞控制Mtb。

MazF5蛋白可与MazE5、MazEF6、MazF3、MazF9等蛋白相互作用，与MazE5的相关性更是高达0.957,作为TA中的毒性成分，其毒性作用可通过与同源抗毒素MazE5共表达来中和。缺失了与MazF5相互作用蛋白的Mtb突变体在抗结核药物治疗后存活率明显降低[7],Zhao等[15]研究发现MazEF3、MazEF6、MazEF9的TA系统促进Mtb存活且其耐药株与药敏株存活能力与MazEF蛋白表达有关。MazF5在耻垢分枝杆菌中表达时能抑制菌落的形成，作为序列特异性核糖核酸内切酶，它能切割广泛的mRNAs,影响整个转录组和翻译组，引起细胞代谢的整体变化。磷酸化是调节和控制蛋白质活性功能的重要机制，主要参与各种病理生理过程，调控细胞的增殖、分化和凋亡，MazF5磷酸化位点主要在丝氨酸、苏氨酸。Mtb感染时机体主要发挥细胞免疫作用，T细胞免疫作为细胞免疫最主要的，它所介导的免疫反应对于控制结核病感染至关重要[16]。抗原表位的研究是Mtb诊断、治疗、预防的重点[17],筛选出的得分较高的12个B细胞优势抗原表位、18个Th细胞优势抗原表位和8个CTL细胞优势抗原表位，具有较好的免疫原性，为新型耐药结核药物的作用靶点指出方向，有助于更好控制和治疗结核病。

参考文献:

[3]冯楠,柳小玲,张杰,等.结核分枝杆菌PPE2的生物信息学分析[J].中国病原生物学杂志,2022,17(11):1252-5,1260.

[5]杨航,努尔塞力克·努素甫,杨亚军,等.结核分枝杆菌rv1985c､rv3807c､rv1981c基因编码蛋白生物信息学分析以及间接ELISA方法的建立[J].中国病原生物学杂志,2021,16(2):143-1439.

[6]常蕴青,李传友,唐神结,等.结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统与持留相关性的研究进展[J].中华传染病杂志,2019(3):189-192.

基金资助:山东省自然科学基金面上项目(No.ZR2021MH401);

文章来源:冯敏,刘畅,苏继营,等.结核分枝杆菌MazF5毒素蛋白的生物信息学分析[J].中国病原生物学杂志,2024,19(08):891-895.