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心肌梗死小鼠不同时间点心肌组织mRNA表达谱的变化

2021-02-26 671 上传者：管理员

摘要：目的分析小鼠心肌梗死(MI)后7、14、28d心肌组织mRNA表达谱的变化。方法将C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(S组)和MI模型组(MI组),每组10只。采用结扎小鼠冠状动脉左前降支方法建立MI模型,行心电图和组织病理学检查验证,心脏彩超观察心脏结构变化。取梗死边缘区心肌组织进行转录组测序,筛选差异表达mRNA基因,采用基因本体(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析参与重要信号通路的差异表达基因。结果MI组建模后3个时间点左心室舒张末期内径及其容积、左心室收缩末期内径及其容积均大于S组,而左心室射血分数低于S组(P<0.05)。MI组建模后3个时间点共280个基因均表达上调,而40个基因均表达下调。GO分析显示,持续表达上调或下调的基因主要参与的生物功能为生物调节、对刺激的反应、代谢过程、发育过程等;细胞成分有细胞膜、细胞核、囊泡、细胞外基质等;分子功能有蛋白结合、转运激活等。KEGG分析显示,持续表达上调的基因参与信号通路多促进心室重塑,持续表达下调的基因参与信号通路多抑制和延缓心室重塑。结论小鼠MI建模后心脏形态结构发生异常,心功能减低;不同时间点进行mRNA谱分析显示涉及基因数目众多且功能复杂。

关键词：
小鼠
心肌梗死
心肌组织mRNA表达谱
心脏彩超
心脏结构变化
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心肌梗死(MI)是在冠状动脉易损斑块基础上,或与心肌氧供需失衡,或与经皮冠状动脉介入治疗相关,或冠状动脉旁路移植术(CABG)后导致冠状动脉的血流急剧减少或中断,使相应部位的心肌出现严重而持久的缺血,最终导致心肌缺血坏死[1]。目前临床采用溶栓及急诊经皮冠状动脉腔内成形术进行治疗,但MI后期许多患者因心室重构,心功能降低,导致心力衰竭,远期预后仍然欠佳。心室重构是临床常见的慢性进行性病理生理过程,心肌细胞凋亡、炎症及细胞因子参与MI后心室重构及心力衰竭等一系列病理生理变化[2]。本实验充分利用生物信息学软件对MI后不同时间段心肌组织mRNA表达谱进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析,筛选出可能参与致病过程的分子信号通路和构建调控功能关系网络,为MI后心室重塑的机制及治疗提供新的靶点和思路。

材料与方法

一、材料

野生型C57BL/6J小鼠由湖北医药学院动物实验中心提供[动物许可证号:SCXK(鄂)2016-0008],8周龄,20只,体重16～18g,雄性,随机数字表法分为MI组(结扎左前降支)和假手术(S)组(只开胸穿线不结扎左前降支),每组10只。AB7500型荧光定量PCR仪(北京安麦格贸易有限公司),超纯RNA提取试剂盒、HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒均由上海生工技术有限公司提供。

二、方法

1.小鼠MI模型构建

用异氟烷麻醉小鼠;在小鼠左侧第3～4肋间剪开皮肤,逐层钝性分离肌肉,迅速将心肌挤出;并于左心耳与动脉圆锥交界下方约2mm处结扎心脏冠状动脉左前降支(MI组);S组仅手术不结扎;立即进行心电图验证两组。

2.心脏结构及功能变化

建模后7、14、28d利用心脏彩超观察小鼠左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期容积(LVEDV)、左心室收缩末期容积(LVESV)、室间隔厚度(IVST)、室壁厚度(PWT)及左心室射血分数(LVEF)等指标的变化。

3.小鼠心肌组织冰冻切片制作

制作小鼠左前降支支配的心肌组织冰冻切片行HE染色。

4.小鼠心肌组织mRNA提取

心脏彩超观察后处死小鼠,MI组和S组取冠状动脉左前降支支配的梗死边缘区心肌组织,提取总mRNA进行测序。

5.基因功能GO分析

基于数据库NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、UniProt(http://www.uniprot.org/)和GOC(http://www.geneontology.org/),分别从生物学过程、细胞组分、分子功能层面进行差异基因GO注释,得到基因参与的所有GO,筛选出差异基因富集的显著性GO。

6.信号通路及其相互作用关系KEGG分析

将筛选出的差异基因在KEGG,分析数据库进行通路注释,得到差异基因参与的所有通路条目,筛选出差异表达基因显著富集的通路条目。选用显著性通路,根据KEGG数据库中通路之间的关联关系整合成显著性通路之间的信号转导网络。

三、统计学处理

采用SPSS21.0软件进行统计学分析。计量数据用均数±标准差(x¯±s)表示,行t检验;计数资料用百分比表示,行χ2检验;P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、两组建模后心电图

两组建模后心电图见图1,仅MI组示ST段显著抬高。

图1两组建模后心电图

二、两组建模后心脏彩超指标

建模后7d,MI组心脏彩超相关指标LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV、IVST、PWT均大于S组,而LVEF低于S组(P<0.05)。建模后14、28d,MI组心脏彩超相关指标LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV均大于S组,而LVEF低于S组(P<0.05)。(表1)

三、两组建模后心肌组织HE染色

两组小鼠左前降支支配的心肌组织HE染色结果见图2。S组左前降支支配的心肌无坏死组织,MI组左前降支支配的心肌有坏死组织。

四、MI组建模后不同时间点基因表达及其分析

MI组建模后7d共1138个基因表达上调,而270个基因表达下调;建模后14d共937个基因表达上调,而210个基因表达下调;建模后28d共390个基因表达上调,而64个基因表达下调。其中建模后7、14、28d共280个基因均表达上调,主要包括Slfn4、Scpep1、Sox9、Serpinf1、Uhrf1基因等。GO功能富集分析结果提示,持续表达上调的基因主要参与生物功能为生物调节、对刺激的反应、代谢过程、发育过程等;细胞成分有细胞膜、细胞核、囊泡、细胞外基质、细胞骨架等;分子功能有蛋白结合、电子结合、转运激活、脂质体结合等,其参与这些功能的基因数目各不同而且复杂。KEGG分析结果提示,持续表达上调的基因主要参与信号通路、细胞周期、转化生长因子β信号通路等,多为促进心室重塑。

表1两组建模后7、14、28d心脏彩超指标

图2两组小鼠心肌组织

MI组建模后7、14、28d共40个基因均表达下调,主要包括Cacna2d2、Sfrp5、Per1、Adam11、Park2、Slc22a1、Cacna1h、Rfx2、4833403I15Rik、Cyp2e1基因等。GO功能富集分析提示,持续表达下调的基因主要参与生物功能为生物调节、多细胞生物过程、对刺激的反应、代谢过程、细胞交流机制、发育过程、定位、细胞增殖等;细胞成分有细胞膜、细胞核、囊泡、细胞外基质等;分子功能有蛋白结合、离子结合、转运激活、水解酶活性、核酸结合等。KEGG分析结果提示,持续表达下调的基因主要参与信号通路、昼夜夹带、心肌细胞收缩、致心律失常型右室心肌病等,多为抑制和延缓心室重塑。

讨论

心肌持续缺血导致心肌细胞大量坏死,细胞间质增生纤维化,瘢痕形成引起心脏重构,其发生机制与交感神经系统激活、肾素-血管紧张素系统活性升高导致过多的儿茶酚胺类物质释放有关。血管紧张素Ⅱ和醛固酮促进血管和心肌的纤维化及压力超负荷诱导的心脏肥厚,这些信号途径具有致病作用并涉及大量细胞类型,包括心肌细胞和免疫细胞[3]。另外有研究表明,脂肪组织不仅具有储能、缓冲和支持作用,还能分泌多种脂肪因子,包括瘦素、脂联素、内脂素、抵抗素、网膜素和趋化素等[4]。提高迷走神经的张力对心脏也具有一定的保护作用,其原因为迷走神经末梢释放的递质乙酰胆碱是心脏重塑的重要调节因子[5]。钙蛋白酶作为一种存在于细胞质中钙离子依赖的半胱氨酸蛋白酶,它的激活在心肌细胞肥大和凋亡中发挥着关键的作用,且该酶的表达情况与心力衰竭的程度呈正相关[6]。心脏重构的形成与发展是由多种因素共同作用产生的,如炎症信号传递、免疫细胞激活、非心肌细胞表型变化、肌小节重排、细胞外基质沉积等,尤其是心肌的炎症反应在心脏肥厚和重构的发生演进过程中的作用更为显著。同时,炎性细胞因子如IL、转移生长因子β和神经体液因子等参与心肌肥厚和重塑的病理生理过程[7]。

抑制和改善机体心室重塑是治疗心力衰竭的重要研究方向。早期的心室重构可通过临床使用药物或者一些特殊的先进治疗技术来阻止或被逆转。目前心室重塑的治疗方法包括血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂、β受体阻滞剂、硝酸酯类、他汀类药物、醛固酮拮抗剂,药物治疗能有效减少心室重构发生率和MI病死率。但随着心肌缺血时间延长、心肌细胞坏死增多及心肌纤维化明显时,常规方法抑制心室重构效果欠佳,因成年哺乳动物心脏内源性再生能力较低,主要是由于心肌细胞的细胞周期阻滞所致。目前尚无促进心脏再生的有效治疗方法。近年来,利用基于DNA或病毒的基因治疗方法诱导MI建模后或心力衰竭条件下的心脏再生的努力遇到了重大挑战,主要是因为导入基因的传递不佳且不受控制。也许改良mRNA是一种安全、非免疫原性、高效、瞬时、局部且可控的核酸传递系统,可以克服DNA或病毒途径传递心脏相关基因的障碍[8]。

转录组指的是从一种细胞或组织基因组所转录出来的RNA总和,包括编码蛋白质的mRNA和各种非编码RNA(核糖体RNA、转运RNA、核仁小分子RNA及微小RNA等)。转录组学研究是从整体水平分析研究基因的功能,揭示特定生物学过程,目前已广泛应用于各类基础研究、临床诊断和药物研发等领域。转录组测序技术利用高通量测序技术将样本中所有的RNA反转录成cDNA,并构建文库进行测序,通过统计相关读段数计算出不同RNA的表达量[9],寻找出两组样本中差异表达的基因。这种方法改变了转录序列的研究方式,主要应用于转录组学的研究。本实验首先成功构建小鼠MI模型,在不同的时间段检测小鼠心脏形态变化及心功能,反映MI后心室增大和心功能降低,存在一定程度的心室重构,利用转录组测序技术检测MI后不同时间点mRNA谱的变化,发现检测到的基因有1000余种,这些基因参与生物功能主要通过丝裂原活化蛋白酶信号通路调控DNA生物合成参与细胞周期;通过Na+-Ca2+通道使细胞内Ca2+浓度增加,通过肌钙蛋白T、肌钙蛋白I和肌钙蛋白C加强心肌收缩偶联,Ca2+-ATP酶活性增加,左心室收缩功能减退,同时机体激活血管紧张素转换酶抑制剂、胰岛样生长因子1、转化生长因子β等,在一些细胞因子如TNF-α、IL-6、血管紧张素Ⅱ及内皮素1的参与下使左心室肥厚,最终导致心力衰竭发生。

在MI建模后不同时间点检测的mRNA谱中同时表达下调的基因有40个,如通过MAPK信号通路起抗凋亡作用,MAPK信号通路在心血管疾病发病机制中也可能起双重作用[10]。MAPK细胞外信号调节激酶(ERK)、C-junN末端激酶(JNK)和p38MAPK在MI后心肌肥厚、心室重塑中均起重要作用;MI后的数分钟内,ERK1/2、JNK1/2和p38MAPK在小鼠和大鼠缺血心肌和左心室未受影响部分均被激活[11,12]。尽管未受影响心肌中各种MAPK的激活在MI后的几天内是可变的,但p38MAPK在最初损伤后的几周内最为持续激活[13,14]。减少病理性心脏重构的一个潜在的分子机制是,关键的抗凋亡蛋白Bcl-XL的去酰胺作用减少[15]。Bcl-XL的去酰胺作用抑制其抗凋亡功能,可能导致其降解。在一项相关的研究中,显性阴性突变p38在转基因小鼠心脏组织中的过度表达导致Bcl-2在基线时的表达增加,而在缺血-再灌注损伤后表达增加[16]。这些结果提示p38MAPK的激活通过降低抗凋亡家族成员Bcl-XL和Bcl-2的活性或表达而促进病理重塑。通过结扎小鼠冠状动脉左前降支建立MI模型,使用p38MAPK抑制剂来评估这种蛋白激酶在MI后心脏重构中的作用,结果显示,MI后接受p38MAPK抑制剂治疗的动物与接受载体治疗的动物相比,两者都未见Bcl-XL和Bcl-2减低[17]。这些持续下调的基因参与的信号可能抑制和延缓心室重塑。因此,开发能抑制MI建模后促进心室重塑的基因、激活延缓心室重塑的基因可能是今后有效治疗心室重塑的新方向和途径。

综上所述,小鼠MI建模后心脏形态结构发生异常,心功能减低,不同时间点进行mRNA谱分析显示涉及基因数目众多,功能复杂,其中持续表达上调的基因参与的信号通路多促进心室重塑,持续表达下调的基因参与的信号多抑制和延缓心室重塑。

参考文献：

[9]孙洪计,魏慧君.RNA-Seq技术在转录组研究中的应用[J].中外医学研究,2018,16(20):184-187.

熊哲,罗心霞,陈操,丁妍,胡恋,王治校.心肌梗死小鼠不同时间点心肌组织mRNA表达谱的变化[J].江苏医药,2021,47(02):114-118.

基金:湖北医药学院自由探索基金(FDFR201803)