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摘要:目的:研究间歇性低氧(IH)对心肌梗死(MI)后C57BL/6小鼠心脏功能的影响及其机制。方法:将24只小鼠随机划分为4组:假手术组(SHAM,n=6)、假手术低氧组(SHAM-IH,n=6)、心肌梗死组(MI,n=6)和心肌梗死低氧组(MI-IH,n=6)。超声心动检测小鼠左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)。Masson染色检测心肌纤维化程度。Tunel染色检测细胞凋亡。蛋白印迹检测丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)蛋白及其磷酸化、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)蛋白及其磷酸化和裂解半胱氨酸蛋白酶3(cleaved caspase 3)蛋白的水平。体外实验用H2O2诱导H9C2细胞损伤以模拟氧化应激,加入MEK/ERK抑制剂(U0126),检测MEK和ERK1/2的蛋白及其磷酸化水平、cleaved caspase 3蛋白水平。结果:(1)干预4周后,与MI组相比,MI-IH组LVEF、LVFS明显增加(t=-15.520、-15.080,均P<0.001),心肌纤维化减少(t=9.547,P<0.05),MEK、ERK1/2的磷酸化、cleaved caspase 3水平均减少(t=2.292、3.267、6.399,均P<0.05),细胞凋亡减少(t=4.341,P<0.001)。(2)与H2O2组相比,H2O2+U0126组MEK、ERK1/2的磷酸化减少,caspase 3活化降低(t=3.599、9.692、6.607,均P<0.05)。结论:IH通过MEK/ERK信号抑制心肌细胞凋亡,从而促进MI小鼠心功能的恢复。
心肌梗死(myocardial infarction,MI)是中国居民致残和致死的主要心血管疾病之一[1]。尽管MI后患者的存活率显著增加,但是MI后患者的再住院率依旧很高,因此如何预防MI后并发症、改善患者生活质量显得尤为重要。心脏康复作为一种常用的治疗方法,可以帮助患者恢复健康,并通过运动等训练手段改善患者心功能,已被美国心脏病学会推荐为ⅠA级指南[2]。近年来,间歇性低氧(intermittent hypoxia,IH)在心血管疾病中得到了广泛研究,被证明有多种生物效应。本课题组前期研究发现IH干预可通过增加MI大鼠δ-阿片类受体表达[3],调控MI大鼠AMP活化蛋白激酶(AMPK)α1/SIRT3通路[4],改善线粒体结构,调节心肌脂肪酸代谢,从而对心脏产生保护作用。
IH在缺血-再灌注的心肌模型中具有调控细胞凋亡的作用[5,6]。心肌细胞损伤主要由心肌细胞的不可逆凋亡引起[7]。此外,细胞凋亡被认为是MI后心肌细胞丢失的主要来源,也是心室重塑和心力衰竭发展的重要因素[8,9]。Caspase依赖的细胞凋亡已被证明在缺血性心肌损伤中发挥重要作用[10],通过观察caspase家族的活跃程度,可以深入地了解细胞凋亡情况。越来越多的证据表明,细胞凋亡会导致严重的左心室功能障碍[11,12]。Z-VAD是经典caspase抑制剂,Liao等[13]研究发现,Z-VAD下调了缺血-再灌注诱导的细胞凋亡,增加了心脏收缩功能的保护作用。因此,制定调节细胞凋亡的策略,对于预防MI后心功能障碍是必要的。
研究发现,丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)1/2信号通路能调节心血管疾病的细胞凋亡过程[14]。在人结肠癌细胞中,抑制MEK/ERK通路可以缓解因轻度缺氧导致的细胞增殖过程[15]。此外,MEK/ERK通路可以减轻缺氧诱导的H9C2细胞损伤[16]。目前,MI后早期IH干预能否抑制MEK/ERK信号转导和MI后心肌细胞凋亡及其内在的机制尚不清楚。因此,本研究旨在通过体内、外研究,探讨IH对MI小鼠心肌组织的影响,进一步探讨细胞凋亡在IH影响心脏损伤中的作用。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
SPF级C57BL/6成年雄性小鼠24只,8周龄,体重18~22 g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,予(21±2)℃、(50±10)%的相对湿度下,12 h的光照和黑暗循环中饲养,自由取水。本实验由天津医科大学总医院实验动物伦理委员会批准(伦理批准号:TMUaMEC2018037)。
1.1.2 试剂
MEK抗体、p-MEK抗体、ERK抗体、p-ERK抗体和cleaved caspase 3抗体购自美国affinity公司;GAPDH抗体购自中国爱博泰克生物科技有限公司;Masson试剂盒购自中国北京索莱宝科技有限公司;Tunel试剂盒购自中国塞维尔生物科技有限公司;DMEM、胎牛血清、链霉素购自美国Gibco公司;大鼠心肌细胞H9C2购自上海中乔新舟生物科技有限公司。
1.1.2 仪器
小动物麻醉机购自中国广东海利集团有限公司;化学发光凝胶成像仪购自中国上海天能科技有限公司;荧光显微镜购自日本OLYM-PUS公司。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及MI造模
24只雄性小鼠随机划分为4组,分别为假手术组(SHAM)、假手术低氧组(SHAM-IH)、心肌梗死组(MI)以及心肌梗死低氧组(MI-IH),每组6只。依据本课题组先前研究方案[17],采用结扎左冠状动脉前降支构建心梗模型。异氟烷麻醉小鼠并固定,于第3、4肋间做一个斜切口,进行肌肉钝性分离后,充分暴露心脏,于左心耳下2 mm处结扎左冠状动脉前降支。SHAM组和SHAM-IH组仅接受胸腔开放手术,未对左冠状动脉前降支进行结扎。模型构建成功后,所有小鼠休息1周。
1.2.2 低氧训练及干预方式
SHAM-IH组和MI-IH组于造模1周后放于低压氧舱内,关闭舱门逐渐升高负压直至形成海拔5 000 m、13%氧浓度状态。4 h/d,5 d/周[4,18],其余两组放于常氧环境下,干预时间4 h/d,5 d/周。
1.2.3 超声心动图
在干预前、干预4周后,分别对小鼠进行超声心动图检查,采用M型超声测量法测得左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、缩短分数(left ventricular shortening fraction,LVFS)。每次测量至少超过5个心动周期,每个周期至少拍摄3~5个图像来测量心功能参数。
1.2.4心肌纤维化检测
4周干预后,将小鼠注射戊巴比妥钠处死,将小鼠心脏组织完整取出,浸泡在4%多聚甲醛中,进行固定2 d左右,在梯度酒精(75%、80%、95%、100%)中分别脱水2 h,随后浸泡于二甲苯中使其透明化。用石蜡包埋组织,冷却。用自动切片机将包埋好的蜡块切片,每张厚度约为5μm。根据试剂说明,将石蜡切片脱水后,用Weigert铁苏木素染色溶液染色8 min、酸性乙醇分化液分化10 s、试剂C蓝化液反蓝4min、丽春红洋红溶液染色10min、磷钼酸溶液清洗1 min、苯胺蓝染色液染色1 min。冲洗后脱水、透明、封片、镜下观察拍照。
1.2.5 心肌组织Tunel检测
心脏石蜡包埋后,放入不同的乙醇浓度(100%、90%、80%、70%)中脱蜡。按照1 9的比例将PBS溶液稀释蛋白酶K,每个样品滴加100μL的蛋白酶K溶液。随后滴加试剂盒中的Equilibration Buffer溶液50μL到每个样本,室温下孵育15 min。加入56μL标记液,在37℃恒温箱中孵育1 h。洗涤样本后,滴加DAPI试剂20μL于样本,室温放置7 min。最后中性树脂封片,荧光显微镜下观察拍照。
1.2.6 细胞培养及分组
大鼠心肌细胞H9C2在添加50μg/mL链霉素和10%胎牛血清的DMEM中培养,37℃下在5%CO2的培养箱中培养。在六孔板上培养H9C2细胞,按照实验要求并将其分为3组,即Control组(Con组)、过氧化氢组(H2O2组)、过氧化氢+MEK抑制剂组(H2O2+U0126组)。Con组不做任何处理,H2O2组和H2O2+U0126组首先用200μmol H2O2处理心肌细胞,诱导氧化应激模型。后H2O2+U0126组中加入10μmol U0126干预16 h[19]。
1.2.7 蛋白印迹检测
用裂解液从组织和细胞中提取蛋白质,通过BCA测定蛋白浓度,根据分子量,用10%的浓缩胶和分离胶进行电泳,电泳90 min,转膜90 min,5%牛血清白蛋白溶液室温封闭1 h。添加稀释后的ERK1/2(1 1 000)、MEK(1 1 000)、pMEK(1 1 000)、p-ERK1/2(1 1 000)、cleaved caspase 3(1 1 000)、GAPDH(1 1 000)抗体4℃下孵育过夜,GAPDH作为内参。添加二抗(1 2 000)37℃孵育1 h,电化学发光液检查特定的蛋白条带,Image J软件测定灰度值。
1.3 统计学处理
采用SPSS 27.0和Graph Pad Prism 9.0软件对所有数据进行处理,符合正态分布的资料以±s表示,当数据满足正态分布和方差齐性,多组间比较采用单因素方差分析。方差不齐采用非参数检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
2、结果
2.1 IH对小鼠生存活动的影响
4周干预过程中4组小鼠均无死亡。但MI组小鼠活动较少,食欲较差,生长缓慢,MI-IH组小鼠活动逐渐恢复正常。
2.2各组小鼠心脏超声结果比较
超声心动结果显示,MI组和MI-IH组左心室前壁运动幅度降低呈平坦状,提示左心室出现梗死。干预前,与SHAM组相比,MI组和MI-IH组LVEF和LVFS均明显下降(均P<0.001);SHAM组和SHAM-IH组间比较无差异,MI组和MI-IH组间比较无差异(均P>0.05)。干预4周后,与MI组相比,MI-IH组的LVEF和LVFS显著增加(t=-15.520、-15.080,均P<0.001);比较干预前、后发现,干预后MI-IH组的LVEF和LVFS较干预前显著增加(均P<0.001),见图1。
图1 小鼠心脏LVEF及LVFS水平
2.3 IH对心肌组织纤维化的影响
Masson染色结果显示,红色区域代表正常心肌范围,蓝色代表心肌纤维化范围。与SHAM组相比,MI组及MI-IH组心肌纤维化明显增加(t=-29.682、-19.682,均P<0.001);与MI组相比,MI-IH组心肌纤维化显著降低,差异具有统计学意义(t=9.547,P<0.001);SHAM-IH组和SHAM组比较差异无统计学意义(P>0.05),见图2。
图2 心脏组织Masson染色
2.4 IH对MEK/ERK通路的影响
心肌组织蛋白质免疫印迹结果显示,MI组和MI-IH组ERK1/2、MEK蛋白与SHAM组相比没有差异(均P>0.05);与SHAM组相比,MI的p-MEK、cleaved caspase 3蛋白表达增加(t=-3.729、-4.595,均P<0.05);与MI组相比,MI-IH组p-ERK1/2、p-MEK、cleaved caspase 3蛋白表达降低(t=2.292、3.267、6.399,均P<0.05),见图3。
图3 蛋白质免疫印迹检测p-MEK、p-ERK1/2、cleaved caspase 3蛋白表达
2.5 IH对细胞凋亡的影响
心肌组织Tunel染色结果显示,SHAM组和SHAM-IH组间的细胞凋亡水平差异无统计学意义(P>0.05)。与SHAM组相比,MI组凋亡阳性细胞数明显增多(t=-8.997,P<0.001)。与MI组相比,MI-IH组凋亡阳性细胞数明显减少(t=4.341,P<0.001),见图4。
图4 心脏组织Tunel染色
2.6 抑制MEK/ERK对H9C2细胞凋亡的影响
蛋白质印迹结果显示:H2O2组和H2O2+U0126组的ERK1/2、MEK蛋白与Con组相比,差异无统计学意义(均P>0.05);与Con组相比,H2O2组p-MEK、cleavedcaspase3蛋白表达明显增加(t=-4.489、-3.606,均P<0.05);与H2O2组相比,H2O2+U0126组的pERK1/2、p-MEK、cleaved caspase 3蛋白表达明显降低(t=3.599、9.692、6.607,均P<0.05),见图5。
图5 蛋白质免疫印迹检测p-MEK、p-ERK1/2、cleaved caspase 3蛋白表达
3、讨论
3.1 IH干预改善MI小鼠的心功能及心肌纤维化
MI是由于动脉内壁斑块生成,心肌缺血缺氧产生的血管损伤、炎症等一系列反应的一种心血管疾病[20]。MI后的心肌胶原持续纤维化会严重损害心脏功能,最终发展为心力衰竭。研究表明,间歇性低氧可以减少MI面积,缓解心肌纤维化,增强运动能力[21]。在本研究中同样发现MI组心肌纤维化程度明显高于Sham组,而IH干预后,心肌纤维化程度明显降低,提示IH可改善心肌纤维化。
MI后胶原纤维增多导致的纤维化增多会影响心脏的收缩功能。LVEF是评估MI后左室收缩功能的重要指标,如LVEF<40%可预测急性MI的死亡率[22,23]。有研究证明IH作为一种无创的干预方式,可以改善心肌组织的舒缩功能[24]。为了探究IH对心脏功能的积极作用,本研究采用超声观察心脏功能,发现MI-IH组与MI组相比,LVEF、LVFS的升高具有统计学意义,提示IH干预4周可显著改善MI小鼠的左室收缩功能。
3.2 IH干预抑制MI小鼠的细胞凋亡
MI后心肌长期缺血缺氧会诱导细胞凋亡,而细胞凋亡则会影响心脏功能。在临床上,由于心肌细胞丢失是患者死亡率的主要决定因素,因此减少细胞凋亡是拯救心血管疾病的关键因素[25]。Caspases家族是细胞凋亡的启动者[26],其中caspase3是细胞凋亡的主要蛋白酶之一。观察caspase 3活化水平可以反映细胞凋亡水平。本研究采用Tunel染色和蛋白免疫印迹检测细胞凋亡水平,MI后心肌细胞凋亡蛋白caspase3活化增多,Tunel阳性凋亡细胞数增加,而在IH干预4周后caspase 3活化明显减少,Tunel阳性凋亡细胞数降低。这些变化表明IH干预可以抑制心梗心脏的细胞凋亡水平,从而改善心脏结构和功能。
3.3 IH干预通过MEK/ERK通路改善抑制细胞凋亡
本课题组前期研究已证实,一定参数的IH对MI心脏的保护作用[3,4],可以减少心肌纤维化,改善心功能。研究表明,MEK/ERK通路在丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中扮演着至关重要的角色,它们可以调控细胞增殖、分化、凋亡等不同的生理过程[27]。而细胞凋亡是由MAPK信号通路介导的最显着的表型之一。研究表明,RGS5基因敲除小鼠MI后出现明显细胞凋亡,可能因为部分激活MAPK信号通路[28]。M1巨噬细胞衍生的细胞外囊泡激活MEK/ERK通路,增加了MI区域的凋亡细胞,降低了血管生长因子的表达,抑制MI后的血管生成和心肌再生[29]。橄榄苦苷通过抑制MEK磷酸化,显著抑制缺血再灌注大鼠的caspase 3的表达[30]。上述研究提示抑制MEK/ERK通路可以抑制细胞凋亡。蛋白印迹结果显示,与MI组相比,MI-IH组MEK、ERK磷酸化蛋白、cleaved caspase 3蛋白表达显著减少。但是MEK、ERK总蛋白水平未有统计学差异,表明IH通过下调MEK、ERK的表达,抑制细胞凋亡。U0126明显抑制了MEK、ERK的活化状态。在体外实验中,发现MEK/ERK抑制剂的使用可明显减少受损心肌细胞的caspase 3活化。这也证实了抑制MEK/ERK信号转导的激活会抑制细胞凋亡,从而加快MI的恢复。
综上所述,本研究通过体外和体内实验,发现小鼠MI后采用IH干预通过抑制心肌MEK、ERK1/2蛋白磷酸化,抑制细胞凋亡,改善心肌纤维化,从而产生心肌保护作用。本研究有望为临床MI后患者的心脏康复提供理论基础与分子机制。但MEK/ERK所调控的表型众多,充分认识MEK/ERK还需要进一步探索。
参考文献:
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基金资助:天津市医学重点学科(专科)建设项目(TJYXZDXK-060B); 天津市卫健委科技项目青年项目(TJWJ2023QN008);
文章来源:丁心语,王俊懿,黄传,等.间歇性低氧通过MEK/ERK信号改善小鼠心肌梗死后心功能恢复[J].天津医科大学学报,2024,30(04):350-355.
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静脉溶栓的药物选择方面主要有阿替普酶、尿激酶、重组人尿激酶原、重组TNK组织型纤溶酶原激活剂等药物,其中阿替普酶具有较高的再通率,且出血事件的发生率较低,安全性较高,因此在急性心肌梗死的治疗中得到了较为广泛的应用[3]。
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2024-08-20冠状动脉(简称冠脉)非阻塞性心肌梗死(myocardial infarction with non-obstructive coronary arteries, MINOCA)是一种由不同发病机制导致的临床异质性疾病,总体发病率占急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)的5%~25%,最近的观察性研究显示该占比约为11%[1]。
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期刊名称:中华心力衰竭和心肌病杂志(中英文)
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主管单位:中国科学技术协会
主办单位:中华医学会
出版地方:北京
专业分类:医学
国际刊号:2096-3076
国内刊号:10-1460/R
创刊时间:2017年
发行周期:季刊
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