颞下颌关节紊乱病是一组影响咀嚼肌和颞下颌关节的肌肉骨骼疾病[1]。其中颞下颌关节骨关节炎(temporomandibular joint osteoarthritis, TMJOA)为颞下颌关节紊乱常见病之一，在口腔疾病中排在第4位，病理表现为软骨细胞凋亡和软骨下骨异常改建，患者可出现下颌活动受限和下颌疼痛[2,3]。骨关节炎降低了患者生活质量，对患者身心造成了极大影响。在骨关节炎中，炎症细胞因子通过细胞内信号传导途径影响细胞因子和酶的产生，从而加重病情的进展[4,5]。IL-1β作为引起炎性反应的主要因子之一，可刺激其他促炎因子的产生，参与多种免疫应答[6]。现如今，TMJOA尚无根治方法，主要是对症治疗(减轻患者疼痛，减缓患者疾病进展，恢复患者关节功能)。TMJOA的治疗方式主要分为保守治疗和手术治疗，由于颞下颌关节具有自我修复和改建的能力，一般多采用保守治疗，在保守治疗效果欠佳的情况下进而选择手术治疗[7,8]。目前关节腔内注射玻璃酸钠为常见治疗方法，但玻璃酸钠价格偏贵，限制了其在临床应用[9]。医用臭氧费用低、可重复治疗、并发症少，逐渐引起广大学者注意。

医用臭氧是一种不稳定、极易溶于血液和组织液的气体。临床中臭氧最先应用于治疗厌氧菌导致的气性坏疽性疾病。随着臭氧发生器的发明[10]和越来越多学者对医用臭氧的深入研究，现如今医用臭氧逐渐被广泛应用于腰间盘突出[11]、骨关节炎等疾病[12,13]。医用臭氧作为一种强氧化物质是一把“双刃剑”,具有生物毒性，使用过量会造成组织损伤，正常范围内使用对疾病起治疗作用[14,15]。前期课题组研究表明大鼠每侧颞下颌关节内注射0.1 mL、浓度为30 μg/mL的医用臭氧，1次/周，对大鼠颞下颌关节骨关节炎有治疗作用[16,17],而目前国内外各机构使用医用臭氧治疗骨关节炎的疗程有所不同。因此本实验通过关节内注射医用臭氧，治疗碘乙酸钠所导致的大鼠颞下颌关节骨关节炎，在不同时间段处死大鼠，观察不同疗程医用臭氧对SD大鼠颞下颌关节骨关节炎的影响。探讨医用臭氧注射疗程对骨关节炎及其疼痛的影响，以期为临床应用医用臭氧提供一定的理论基础。

1、材料与方法

1.1 实验动物及饲养环境

雄性SPF级SD大鼠54只(由新疆医科大学动物实验中心提供),8周龄，体质量210～250 g。实验过程中严格遵循《关于善待实验动物的指导性意见》,尽一切努力最大限度地减少SD大鼠痛苦和死亡。实验前所有大鼠在饲养室(室温21～25 ℃,光照和黑暗各12 h)适应性喂养1周。该实验经新疆医科大学第一附属医院动物伦理委员会批准(审批号： IACUC-20160218-001)。

1.2 仪器及试剂

碘乙酸钠(上海麦克林生化科技有限公司，中国);大鼠白细胞介素(interleukin, IL)-1β ELISA 试剂盒(上海将来实业股份有限公司，中国);切片机、包埋机、显微系统 (Leica, 德国);医用臭氧发生器(Hermann 公司，德国);Von Frey纤维丝疼痛测量包(North Coast, 美国);恒温箱 (上海爱朗仪器有限公司，中国);酶标仪(Bio-Rad, 上海);防脱载玻片(江苏世泰实验器材有限公司，中国);高速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司，中国)。

1.3 动物模型

按随机数字表法将大鼠分为对照组、模型组、医用臭氧组每组18只。0.3%戊巴比妥钠(10 mL/kg)腹腔注射，麻醉起效后将生理盐水50 μL分别注射到对照组大鼠双侧颞下颌关节腔内，将碘乙酸钠溶液50 μL(2 mg 碘乙酸钠溶于50 μL生理盐水)分别注射到其余36只SD大鼠双侧颞下颌关节腔内[18]。注射方法为：触摸大鼠颧弓根部，进针方向为前上内，抵骨面后稍退针，回抽无血即可注射，使用注射器为1 mL胰岛素注射器(29 G针头)。大鼠颞下颌关节区痛阈值下降、梳毛洗脸频繁、进食量减少、关节部位肿胀说明建模成功。建模成功后，注射30 μg/mL医用臭氧对医用臭氧组大鼠颞下颌关节骨关节炎进行干预，每侧注射0.1 mL。注射医用臭氧1、3、5周各组分别麻醉处死6只大鼠进行取材。

1.4 机械痛阈值检测

注射医用臭氧1、3、5周采用Von Frey纤维丝垂直刺激SD大鼠颞下颌关节区域进行50%机械缩头阈值(mechanical head-withdrawal threshold, MHWT)检测，以此评估大鼠机械痛阈值。测试前将大鼠放入测试笼中适应约30 min, 待其安静后，采用up-down法，取一系列不同力度的Von Frey纤维丝，从4.0 g力度开始对大鼠颞下颌关节区施加压力进行刺激，使纤维丝成“C”或“S”状弯曲并维持6～8 s, 大鼠出现以下表现记为阳性反应：①大鼠将头部移开或向后移动并且进行测试部位脸擦拭。②大鼠不与刺激对象接触或将身体从刺激对象移开，并且咬和抓刺激对象。③在刺激的面部区域大鼠表现出不间断的至少3次面部清洗动作。若大鼠对刺激没有反应，则给予大一级力度的纤维丝刺激，如果有反应则改用小一级力度的纤维丝刺激，反复类推，从有反应的那一次开始测 5 次，得到一串以“O”或“X”组合的序列，根据测量所得“X”、“O”序列查“up-down”法系数k对照表后得到的值为k值，后代入公式大鼠50%机械缩头阈值(g)=[10(Xf+kδ)]/10 000即可计算，其中Xf为最后一根测试丝编号；δ为各个纤维丝力度取lg后的均差，测试结果以g表示。

1.5 关节液中IL-1β表达水平的测量

在注射医用臭氧1、3、5周，大鼠处于麻醉状态下，将生理盐水50 μL注入大鼠右侧颞下颌关节腔内，后抽取关节液。放于离心机内，设置离心机转速为3 000 r/min ,时间为15 min, 离心后取上清液，储存于-80 ℃冰箱备用。使用ELISA试剂盒检测关节液中IL-1β表达水平，然后将不同浓度的标准品、稀释后的关节上清液，分别加入酶标板内进行孵育、洗涤等操作，酶标波长设置为450 nm, 测出待测样本吸光度值，读取数值后，计算样品IL-1β表达水平，结果以(ng/mL)表示。

1.6 颞下颌关节软骨大体观及Pelletier 评分

麻醉处死各组大鼠后，大体观察颞下颌关节软骨色泽及表面光滑度。根据Pelletier 评分，可将软骨病损程度分为5级，1级：关节表面光滑为0分；2级：关节表面粗糙、有小裂隙为1分；3级：关节表面糜烂，软骨缺损深达软骨表层或中层为2分；4级：关节面溃疡形成，缺损深达软骨深层为3分；5级：软骨剥脱，软骨下骨质暴露为4分。

1.7 采用苏木精-伊红染色对大鼠颞下颌关节软骨组织进行形态学检测

处死大鼠后，将大鼠头部去皮，于40 g/L多聚甲醛中固定72 h, 后流动水冲洗过夜，通过脱钙、包埋，切取厚度为4 μm的组织切片，常规苏木精-伊红染色，参照改良Mankin's评分，对各组大鼠颞下颌关节组织进行对比。颞下颌关节软骨改良Mankin's评分如下，①软骨结构评分标准：结构正常，表面光滑平整为0分；结构基本完整，表面形态不规则，凹凸不平为1分；各层次轻度紊乱为2分；软骨内有裂隙并且深达增殖层为3分；裂隙深达肥大层为4分；裂隙深达钙化软骨层为5分；全层紊乱无法分清结构为6分。②软骨细胞评分标准：正常为0分；弥散性细胞增多为1分；增生性细胞聚集成簇为2分；软骨细胞数量显著减少为3分。③软骨潮线评分标准：完整为0分；潮线中断或难以辨别为1分。

1.8 统计学分析

采用SPSS 26.0软件包对研究结果数据进行统计学分析，使用GraphPad Prism 9.0软件做图。计量资料以表示，假设检验采用双因素方差分析进行统计学分析，检验水准α=0.05,P<0.05为差异具有显著性。

2、结果

2.1 机械痛阈检测结果

如图1所示，同一时间内：1、3、5周模型组与1、3、5周对照组相比，模型组大鼠50% MHWT降低(P<0.01);医用臭氧组与模型组相比，3周和5周医用臭氧组大鼠50% MHWT升高(P<0.01),1周医用臭氧组大鼠50% MHWT虽有升高但无显著性(P>0.05)。同一组内：3周和5周医用臭氧组与1周医用臭氧组相比，大鼠50% MHWT升高(P<0.01),而3周与5周医用臭氧组相比大鼠50% MHWT无显著性(P>0.05)。以上结果表明医用臭氧注射3周以上可以改善大鼠50%MHWT,减轻大鼠颞下颌关节疼痛。

图1 医用臭氧对颞下颌关节骨关节炎大鼠50%机械缩头阈值的影响  

2.2 ELISA试剂盒检测结果

如图2所示，同一时间内：模型组与对照组相比，模型组大鼠颞下颌关节液中IL-1β表达水平升高(P<0.01);医用臭氧组与模型组相比，3周和5周医用臭氧组大鼠颞下颌关节液中IL-1β表达水平降低(P<0.01),1周医用臭氧组大鼠颞下颌关节液中IL-1β表达水平虽有降低但无显著性(P>0.05)。同一组内：3周和5周医用臭氧组与1周医用臭氧组相比，大鼠颞下颌关节液中IL-1β表达水平降低(P<0.01),而3周和5周医用臭氧组大鼠颞下颌关节液中IL-1β表达水平变化无显著性(P>0.05)。以上结果表明医用臭氧注射3周以上可以降低大鼠颞下颌关节液中IL-1β表达水平。

图2 各组大鼠颞下颌关节液中白介素-1β水平的对比   

2.3 各组大鼠颞下颌关节软骨大体观及Pelletier评分结果

如图3 所示，1、3、5周对照组，软骨表面光滑有光泽；随着时间的延长，1、3、5周模型组关节软骨逐渐变形，且表面凹凸不平失去光泽，3周和5周颞下颌关节软骨表面糜烂，缺损达软骨深层，严重的甚至出现软骨剥脱，软骨下骨质暴露。1、3、5周医用臭氧组大鼠颞下颌关节软骨表面无光泽，软骨表面形态较正常。如图3、表1所示：同一时间内，1、3、5周模型组相比于对照组大鼠颞下颌关节软骨Pelletier评分增加(P<0.01);医用臭氧注射1周相比于模型组，大鼠颞下颌软骨Pelletier评分无显著性(P>0.05),医用臭氧注射3周和5周相比于模型组，软骨Pelletier评分减少(P<0.01)。同一组内：随着给药时间的延长，1、3、5周模型组Pelletier评分持续走高， 3周、5周模型组相比于1周模型组，大鼠颞下颌关节软骨Pelletier评分增加(P<0.01);医用臭氧干预后，医用臭氧组Pelletier评分维持在一个相对稳定水平， 1、3、5周医用臭氧组，大鼠颞下颌关节软骨Pelletier评分无显著性(P>0.05)。以上结果表明医用臭氧注射3周以上可改善大鼠颞下颌关节骨关节炎软骨大体观和降低颞下颌关节软骨Pelletier评分。

图3 各组大鼠颞下颌关节大体观典型图片  

表1 各组大鼠颞下颌关节软骨Pelletier评分

2.4 苏木精-伊红染色组织形态学检查

光镜下苏木精-伊红染色，如图4所示，1、3、5周对照组，软骨表面光滑无明显病理学改变，髁突软骨四层结构(纤维层、增殖层、肥大层和钙化软骨层)分布均匀，无裂隙，软骨细胞排列有序；随着时间的延长，1、3、5周模型组颞下颌关节软骨细胞排列不规则、全层紊乱、软骨结构不清、软骨变薄、出现大量纤维软骨细胞、潮线不完整，3周、5周尤为明显，而医用臭氧组大鼠颞下颌关节软骨表面较光滑、四层结构较清晰、排列整齐且紧密、软骨细胞增生。如图4、表2所示：同一时间内，1、3、5周模型组相比于对照组大鼠颞下颌关节软骨改良Mankin's评分增加(P<0.01)。医用臭氧注射1周后相比于模型组，大鼠颞下颌软骨改良Mankin's评分无显著性(P>0.05),而在医用臭氧注射3周和5周相比于模型组，软骨改良Mankin's评分降低(P<0.01)。同一组内：随着给药时间的延长，1、3、5周模型组Mankin's评分持续走高， 3周、5周模型组相比于1周模型组，大鼠颞下颌关节软骨Mankin's评分增加(P<0.01);医用臭氧作用后，医用臭氧组Mankin's评分维持在一个相对稳定水平， 1、3、5周医用臭氧组，大鼠颞下颌关节软骨Mankin's评分无显著性(P>0.05)。以上结果表明医用臭氧注射3周以上可改善大鼠颞下颌关节软骨病理损害。

图4 注射医用臭氧各组大鼠颞下颌关节组织形态学变化 (苏木精-伊红染色 ×200)   

表2 各组大鼠改良Mankin's评分

3、讨论

TMJOA作为颞下颌关节紊乱的重症表现，患者可出现关节区弹响、摩擦音、张口受限，特别是颞下颌关节区慢性疼痛等临床症状[19]。颞下颌关节疼痛是患者就诊急需解决的问题，其发病受多种因素的影响，在颞下颌骨关节炎中，免疫复合物和补体等攻击中性粒细胞，可释放出活性氧、NO及超氧化物阴离子等氧自由基，并形成活泼的羟自由基，打破机体氧化系统与抗氧化系统平衡。羟自由基可激活基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP),同时TMJ内会释放TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8等细胞因子[20]可促进蛋白酶的释放并刺激炎症介质的表达，这些机制可导致颞下颌关节炎症、骨骼和软骨的退化[21]。颞下颌骨关节炎发病因素中IL-1β表达水平对关节炎及其疼痛的作用有着密切影响，是软骨退变和降解主要的促炎因子，关节炎患者中IL-1β表达水平明显升高[22,23,24,25]。本研究使用碘乙酸钠造模后，大鼠颞下颌关节机械痛阈值、颞下颌关节液中IL-1β表达水平、关节软骨Pelletier评分和改良Mankin's评分升高，表明成功构建了大鼠颞下颌关节骨关节炎模型。

目前用于治疗颞下颌关节骨关节炎的方法为物理疗法、口服药物、黏弹性补充疗法(关节腔内透明质酸钠注射)等。根据治疗效果及不良反应大小的影响，近年来，关节腔内注射药物受到临床医生欢迎，由于医用臭氧费用低、并发症小、有良好的镇痛作用，被认为是一种有前途的减轻疼痛的新疗法，为广大学者所关注。

近年来医用臭氧用于治疗关节类疾病起到了良好效果。杨萍萍等通过医用臭氧联合物理疗法来治疗颞下颌关节不可复性关节盘前移位，结果表明，医用臭氧可明显缓解颞下颌关节不可复性关节盘前移位引起的疼痛，并促进关节功能运动[26]。史丽璞等通过使用医用臭氧治疗患者膝骨关节炎，结果表明医用臭氧可改善患者关节痛阈值和关节功能[27]。

医用臭氧可分解出氧气，从而显著提高组织周围氧含量，修复损伤软骨，有利于改善组织微循环，并能抑制组织中致炎因子[28]。由于医用臭氧具有强氧化性，医用臭氧的氧化强度主要受其浓度、用量、注射疗程的影响。医用臭氧浓度在正常范围内可以起到治疗疾病的作用，当注射浓度低于或超过一定范围时不仅起不到治疗作用反而会对患者有一定伤害作用。张婉霞等研究表明关节腔内注射20、30 μg/mL医用臭氧时，可改善骨关节炎，当医用臭氧浓度上升到40 μg/mL时，会加重骨关节炎进程[17]。

目前对医用臭氧在颞下颌关节骨关节炎及疼痛的基础研究较少，且研究者将目光集中在臭氧的浓度上，对医用臭氧注射疗程在疾病的作用考虑较少[29,30]。本实验通过碘乙酸钠构建大鼠颞下颌关节骨关节炎疼痛模型后，将30 μg/mL医用臭氧注入大鼠颞下颌关节腔内进行干预， 1、3、5周分别检测医用臭氧对大鼠颞下颌关节机械痛阈值、大鼠颞下颌关节液中IL-1β表达水平、大鼠颞下颌关节软骨大体观及软骨病理变化，结果表明，医用臭氧注射3周以上可改善大鼠颞下颌关节机械痛阈值以及软骨大体观和病理变化，并降低颞下颌关节液中IL-1β表达水平。在本研究中，1周医用臭氧注射后对大鼠颞下颌关节骨关节炎及其疼痛的治疗作用不明显，其原因可能由于医用臭氧属于强氧化剂，会产生氧自由基，并且在短期内不能诱导抗氧化酶的过多增加，从而对疾病的治疗作用起效不明显或并不能发挥治疗作用[31,32]。

综上，颞下颌关节腔内医用臭氧的应用不仅要控制其浓度也要注意注射疗程。本研究表明，30 mg/L医用臭氧，每侧颞下颌关节腔内注射0.1 mL,1次/周，注射3周以上可改善大鼠颞下颌关节骨关节炎及其疼痛，为医用臭氧在临床应用提供了一定基础研究。

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[27]史丽璞,王旭,郇稳.医用臭氧对膝骨关节炎患者疼痛程度､关节功能及血清NO､SOD､MDA的影响[J].风湿病与关节炎,2021,10(2):11-14.

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文章来源:鲁彩霞,张思敏,尼格阿依·艾合麦提,等.医用臭氧注射疗程对大鼠颞下颌关节骨关节炎及其疼痛作用的影响[J].口腔医学,2024,44(05):362-368.