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网络药理学和分子对接技术分析甲硝唑治疗卵巢癌作用机制

2024-08-08 9 上传者：管理员

摘要：目的基于网络药理学和分子对接技术分析甲硝唑治疗卵巢癌潜在可能性及作用机制。方法通过化学数据库PubChem查找甲硝唑的分子信息和分子结构，通过PharmMapper数据库获得甲硝唑潜在的药效团靶点，通过OMIM、PharmGkb、TTD、GeneCards四大数据库收集卵巢癌相关靶点。运用R语言(4.3.1),最终筛选出甲硝唑与卵巢癌的交集靶点基因。应用String在线平台获得蛋白相互作用(PPI)网络，再通过Cytoscape软件进行拓扑分析，找到核心靶点。利用R(4.3.1)对潜在靶点进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。借助在线数据库GEPIA2深入分析核心靶点在卵巢癌中的表达及预后。利用Autodock Vina软件进行药物与核心靶点的分子对接。结果共筛选出甲硝唑的潜在作用靶点68个，卵巢癌相关作用靶点12 255个，其中交集靶点56个，GO分析共富集到309个条目，KEGG分析则富集到24条信号通路，最终确定治疗卵巢癌的核心靶点2个，分别为HSP90AA1和MDH2。通过核心靶点基因表达及预后分析，显示MDH2在治疗中具有关键作用。分子对接显示，MDH2与甲硝唑结合活性强。结论甲硝唑能够通过调控多条信号通路而发挥治疗卵巢癌的作用，MDH2是其治疗卵巢癌的核心与关键靶点。

关键词：
MDH2
分子对接
卵巢癌
甲硝唑
网络药理学
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甲硝唑是硝基咪唑类衍生物，目前被广泛应用于治疗厌氧菌、滴虫、阿米巴原虫等多种病原体引发的感染[1-2]。目前已有研究表明，甲硝唑在肿瘤治疗领域显示出潜在的应用价值。Kawamoto等[3]研究证实甲硝唑在吉西他滨耐药胆管癌细胞中具有抑制侵袭性和增强化疗敏感性的作用，表明甲硝唑有望成为一种潜在的肿瘤治疗药物。然而，目前关于甲硝唑在肿瘤治疗领域的研究仍较有限，特别是其在卵巢癌治疗中的潜力尚未被深入探讨。本研究采用网络药理学分析方法，旨在发现甲硝唑潜在治疗靶点及相关信号通路，并通过分子对接技术进行验证，以初步揭示甲硝唑在治疗卵巢癌方面的潜在作用机制，为未来的临床研究提供理论依据。

1、材料与方法

1.1甲硝唑结构及其药效团靶点获取

通过分析化学数据库PubChem(https: //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取甲硝唑的分子信息和分子结构。利用PharmMapper数据库(https: //www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)识别甲硝唑可能的潜在候选药效团靶点。利用Perl语言对获取的候选药效团靶点进行注释，获得对应的候选基因。

1.2卵巢癌相关靶点收集

在人类在线孟德尔遗传数据库(OMIM,https: //www.omim.org/)、药物基因组学知识库(PharmGkb, https: //www.pharmgkb.org/)、治疗靶点数据库(TTD,https: //db.idrblab.net/ttd/)和人类基因数据库(GeneCards, https: //www.genecards.org/)中以“ovarian cancer”和“ovarian neoplasms”为检索词进行搜索，搜集卵巢癌相关靶点信息，并利用R语言(4.3.1)进行数据整理。使用R(4.3.1)检索甲硝唑与卵巢癌的共同靶点，并绘制韦恩图展示交集部分。

1.3 PPI网络构建

将甲硝唑与卵巢癌作用的共同靶点导入String数据库(https: //string-db.org/),分析这些靶点之间的相互作用，构建蛋白相互作用(PPI)网络。将PPI网络数据导入Cytoscape软件，利用CytoNCA插件对网络中的节点进行拓扑分析，从中筛选出卵巢癌治疗的重要核心靶点。

1.4基因富集分析

应用R(4.3.1),以P<0.05作为筛选标准，对甲硝唑治疗卵巢癌的潜在靶点进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。GO富集分析涵盖生物学过程、细胞组分、分子功能3个方面，并对结果进行可视化处理。

1.5核心基因表达情况

利用在线数据库GEPIA2(http: //gepia2.cancer-pku.cn/#index),分析治疗卵巢癌的核心靶点基因在肿瘤组织和正常样本中的基因表达差异情况，同时评估核心基因在卵巢癌患者中表达与生存预后之间的关联。

1.6分子对接验证

使用核心靶点作为受体，甲硝唑作为配体进行分子对接。通过PubChem数据库获取配体的2D结构文件，利用Chem3D进行结构转化。通过UniProt数据库获取受体的PDB ID,进而从PDB蛋白质数据库(RCSB PDB,https: //www.rcsb.org/)获取受体的蛋白质结构。利用Autodock Tools1.5.6软件和Autodock Vina软件实现配体和受体之间的分子对接，评估相互结合力。

2、结果

2.1甲硝唑及卵巢癌相关靶点信息

通过PubChem数据库获取甲硝唑的分子2D结构，利用PharmMapper数据库识别提取甲硝唑可能的潜在药效团靶点，利用Perl语言对获取的候选药效团靶点进行注释和整理，最终得到甲硝唑潜在的作用靶点68个。

2.2卵巢癌相关靶点信息

在OMIM、PharmGkb、TTD和GeneCards数据库中以“ovarian cancer”和“ovarian neoplasms”为检索词进行搜索，依次得到172、6 248、76和9 360个卵巢癌相关靶点。通过R(4.3.1)软件进行数据整理去重后，合并得到共12 255个关联卵巢癌的靶点。

2.3甲硝唑治疗卵巢癌的潜在靶点

经过R(4.3.1)软件分析，对甲硝唑的潜在作用靶点和之前整合得到的卵巢癌相关总靶点进行比对，结果显示二者有56个交集靶点，即被确认为甲硝唑治疗卵巢癌的潜在靶点，其韦恩图见图1。

2.4 PPI网络构建与核心靶点分析

56个潜在治疗靶点被导入String数据库，设置置信度分数≥0.9,并隐藏网络中的孤立节点，生成展示潜在治疗靶点相互作用的PPI网络图。将这些数据导入Cytoscape软件，对网络中的节点进行拓扑分析，计算BC、CC、DC、EC、LAC、NC这6项参数的中位值高于阈值的靶点。经过2次筛选，得到2个核心靶点基因，分别为HSP90AA1和MDH2,见图2。

图1甲硝唑治疗卵巢癌的潜在靶点

2.5靶点的功能富集分析

利用R(4.3.1),根据P<0.05的标准对56个潜在治疗靶点进行GO富集分析，共富集得到229个与生物学过程相关的条目，26个与细胞组分相关的条目，54个与分子功能相关的条目。在气泡图中，按照P值大小分别选取每个分类的前10名条目进行展示，见图3。具体而言，生物过程主要涉及小分子代谢过程、端粒酶的维持与调控、DNA的合成及mRNA的稳定等。细胞组分主要包括膜筏、膜微域、泛素连接酶复合物、端粒酶全酶复合物、DNA损伤位点和双链断裂位点等。分子功能主要包括泛素蛋白连接酶结合、组蛋白去乙酰化酶结合、氧化还原酶活性及RNA外切酶活性等。

通过R(4.3.1),根据P<0.05的标准对收集到的56个潜在治疗靶点进行KEGG通路富集分析，共得到24条信号通路，包括了一些重要通路，如IL-17信号通路、TGF-β信号通路、程序性凋亡通路及一些分子的合成和代谢通路等。KEGG富集分析图见图4。

图2核心靶点拓扑分析图

图3GO富集分析结果图

2.6核心靶点基因表达情况探索

将经过拓扑分析计算得出的2个核心靶点HSP90AA1和MDH2分别导入在线数据库GEPIA2进行分析。发现MDH2在卵巢癌组织和正常组织中的表达存在显著差异，其在肿瘤组织中存在高表达，差异有统计学意义，而HSP90AA1表达则未表现出差异性。进一步分析MDH2对生存预后的影响发现，MDH2高表达的患者总生存期(OS)更短，差异有统计学意义，见图5。这些发现进一步支持MDH2可能是甲硝唑在卵巢癌治疗中的关键靶点。

2.7分子对接验证

通过Autodock Vina软件对筛选得到的核心靶点MDH2与甲硝唑进行分子对接，得出其相互作用结合能为-4.8 kcal/mol。一般认为，配体和受体结合越稳定，其结合能值越低，当二者结合能小于-1.2 kcal/mol时，被认为其结合活性较好。因此，根据本研究结果，可以得出甲硝唑与MDH2之间存在较强的结合力。

3、讨论

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，也是妇科恶性肿瘤中病死率最高的癌种。根据2020年的全球肿瘤统计数据，全球新增卵巢癌病例约31万例，其中死亡病例达20万例[4]。在中国，卵巢癌同样是严重威胁女性健康的重要公共卫生问题。据估算，2020年我国约有5.5万例新发病例和3.7万死亡病例[5]。卵巢癌常因病情隐匿，早期缺乏典型症状而导致发现时已进入晚期，晚期患者生存率仅为30%～40%。目前，卵巢癌的治疗以手术、化疗和靶向治疗为主。尽管近年来卵巢癌治疗技术不断取得进步，但卵巢癌的5年生存率仍低于50%[6],因此寻找新的抗卵巢癌药物具有重要的临床意义。

图4KEGG富集分析结果图

图5核心靶点基因表达

目前，卵巢癌的一线治疗方案仍是手术联合以铂类药物为基础的化疗[5]。近年来，靶向治疗药物如抗血管生成药物和多聚ADP核糖聚合酶抑制剂等已被引入卵巢癌的一线维持治疗，有效延长了患者的无进展生存期和总生存期。然而，多聚ADP核糖聚合酶抑制剂主要适用于具有BRCA基因突变的少数患者，其应用范围有限。然而尽管接受标准治疗，多数患者仍会经历肿瘤复发和转移[7]。复发和转移患者常面临药物耐药和严重不良反应的威胁，进而导致不良结局。这些困难限制了卵巢癌治疗的有效性，迫切需要寻找新的安全有效的药物治疗方案。

作为常用的抗感染药物，甲硝唑具有优良的药代动力学、安全性和耐受性[4-5]。最近研究表明，甲硝唑可抑制多种恶性肿瘤活性，其机制涉及抑制细胞增殖、促进细胞凋亡及诱导间充质—上皮细胞转化等多个方面，如在胆管癌细胞系中，甲硝唑可以通过诱导间充质—上皮细胞转化降低胆管癌细胞的侵袭性。进一步研究表明，甲硝唑通过抑制乙醛脱氢酶活性，增强1型平衡型核苷转运体和减少核苷酸还原酶M1的表达，提高胆管癌细胞对吉西他滨的敏感性[6]。这些结果表明甲硝唑通过不同途径在多种恶性肿瘤中发挥调控作用。在卵巢癌方面，研究表明乙醛脱氢酶1的高表达与卵巢癌的发生、耐药和预后不良相关[8]。然而，目前尚无研究证明甲硝唑在卵巢癌治疗中的作用，其具体抗癌机制仍有待进一步探索。

本研究采用网络药理学方法系统研究了甲硝唑在卵巢癌治疗中的潜在作用靶点和机制。初步筛选得到56个潜在治疗靶点，并借助拓扑分析，确定了HSP90AA1和MDH2 2个核心靶点。进一步分析表明，MDH2在卵巢癌患者中明显高表达，且MDH2高表达患者的OS较短，相比之下，HSP90AA1的表达在卵巢癌中未显示出类似差异，因此MDH2被确认为关键靶点。MDH2是一种蛋白编码基因，在三羧酸循环中发挥重要作用，通过NAD/NADH辅酶系统促进苹果酸转化为草酰乙酸。此外，MDH2还参与苹果酸/天冬氨酸穿梭，并在细胞质和线粒体之间的能量代谢协调中发挥关键作用[9]。泛素化的MDH2降解可能影响AMPK/mTOR信号通路，促进细胞自噬和细胞凋亡的发生，因此MDH2可能成为肿瘤治疗中一个重要的潜在靶点[10]。不仅如此，研究表明，MDH2在非小细胞肺癌和子宫内膜癌等疾病中已展现出潜在的治疗价值，其异常表达可能与肿瘤发生密切相关[11-12],为MDH2在肿瘤治疗中的应用提供了新的可能性。

为了深入探究甲硝唑在卵巢癌治疗中的作用机制，本研究进行了GO和KEGG通路富集分析。GO分析显示，甲硝唑治疗卵巢癌涉及的生物过程主要包括小分子代谢、DNA合成和mRNA稳定等。在分子功能方面，主要涉及泛素蛋白连接酶结合、组蛋白去乙酰化酶结合和氧化还原酶活性等。肿瘤细胞通常依赖糖酵解来提供能量，而MDH2的累积有助于促进糖酵解，从而促进肿瘤细胞的异常增殖[10]。组蛋白去乙酰化结合和氧化还原酶活性在细胞能量代谢中起重要作用。因此，GO分析所涉及的分子功能和生物学过程在肿瘤发展中具有关键作用，与核心基因MDH2相关。因此，这些生物过程可能在甲硝唑治疗卵巢癌中发挥重要作用。KEGG通路富集分析显示，交集基因主要富集于IL-17信号通路、TGF-β信号通路和程序性凋亡通路等。MDH2被报道与程序性凋亡通路相关。IL-17信号通路中的关键分子IL-17A被发现可诱导糖酵解代谢的转录和功能程序，而糖酵解是肿瘤进展和转移的重要推动因素[13]。因此，KEGG通路富集的IL-17信号通路和程序性凋亡通路可能是甲硝唑治疗卵巢癌的关键通路。对于进一步探索甲硝唑与MDH2的结合性能，本研究进行了分子对接研究，结果显示甲硝唑与MDH2之间具有较强的结合活性，提示甲硝唑在治疗卵巢癌方面具有潜在可行性。

综上所述，本研究基于网络药理学和分子对接方法，初步展示了甲硝唑在治疗卵巢癌方面的潜在可能性、治疗靶点和作用机制，为开发新的治疗方案提供了线索，同时也为未来更深入的临床研究奠定了理论基础。

利益冲突所有作者声明无利益冲突

参考文献:

[5]李一帆,李宁.中国卵巢上皮癌靶向治疗现状及进展[J].中国妇产科临床杂志,2023,24(4):337-341.

[6]张梦培,尹如铁.上皮性卵巢癌:化学治疗现状及进展[J].中国癌症防治杂志,2023,15(5):477- 484.

[7]杨洁,向阳.2023年度卵巢癌药物治疗研究进展[J].肿瘤综合治疗电子杂志,2024,10(1):58- 62.

[9]汪新颖,王波,侯松涛,等.苹果酸脱氢酶的结构及功能[J].生物学杂志,2009,26(4):69-72.DOI:10.3969/j.issn.1008- 9632,2009.04.069.

基金资助:广东省医学科学技术研究基金(A2022317);

文章来源:许悦,吴楚玲,庄圆,等.基于网络药理学和分子对接技术分析甲硝唑治疗卵巢癌的作用机制[J].临床合理用药,2024,17(23):36-40+47.