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高良姜素减轻乙型病毒性肝炎模型大鼠的炎性反应

2024-10-31 10 上传者：管理员

摘要：目的探讨高良姜素(Gal)对乙型病毒性肝炎(乙肝)大鼠炎性反应的影响。方法大鼠随机分为对照组、乙肝组[尾静脉注射乙型肝炎病毒(HBV)]、Gal低(Gal-L)和高剂量(Gal-H)组、阳性药拉米夫定组、Gal-H+AMPK抑制剂(compound C)组，每组12只。造模后进行药物处理，给药1次/d,持续8周。检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、谷草转氨酶(AST)水平；HE染色检测肝组织病理变化；TUNEL染色检测细胞凋亡；染色质免疫共沉淀检测HBV病毒载量；ELISA检测肝组织中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素(IL-12)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平；Western blot检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、p-AMPK、SIRT1蛋白表达。结果与乙肝组比较，Gal-L组、Gal-H组、拉米夫定组肝脏损伤减轻，血清中AST、TBIL、ALT水平降低，肝组织中细胞凋亡率、HBV病毒载量、MCP-1、IL-12、TNF-α水平及caspase-3、Bax蛋白降低，p-AMPK、SIRT1蛋白升高(P<0.05);Compound C减弱了高剂量Gal对乙肝大鼠肝组织中炎性反应、细胞凋亡及HBV病毒载量的抑制作用。结论 Gal抑制乙肝大鼠炎性反应的机制可能与上调AMPK/SIRT1通路有关。

关键词：
AMPK/SIRT1
乙肝
炎性反应
肝损伤
高良姜素
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乙型病毒性肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染引起的威胁人类健康的重要疾病。目前，治疗HBV感染的最常见药物是免疫调节剂和核苷反转录酶抑制剂，然而上述药物均有一定的副作用[1]。因此，未来的抗HBV治疗迫切需要有效的新型抗病毒药物。高良姜素(galangin, Gal)是一种天然活性化合物，其在治疗肿瘤、糖尿病、肝损伤等方面具有很好的效果。已有研究报道，Gal可减轻刀豆球蛋白A诱导的肝炎小鼠肝损伤[2]。表明Gal具有保肝作用。目前关于Gal或Gal相关饮片定位于HBV感染的研究很少见，Gal对HBV感染的乙肝大鼠能否发挥肝保护作用尚不可知。相关研究显示，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子1(SIRT1)通路的激活减轻了乙肝大鼠肝组织损伤，保护了其肝功能[3];且Gal可通过增加p-AMPK、SIRT1蛋白表达来减轻镉诱导的大鼠肾损伤[4]。但Gal是否可通过调控AMPK/SIRT1信号通路对乙肝大鼠发挥肝保护作用尚不明确。因此，本实验主要通过构建乙肝大鼠模型，探究Gal对乙肝模型大鼠的影响以及作用机制。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1 .1 动物：

生产许可证号为SCXK(冀)2021-003的72只雄性SD大鼠(SPF级，体质量210～220 g)购自赛业(固安)生物公司。本研究取得河北联合大学实验动物中心动物伦理委员会批准(2023-02-621)。

1.1.2 试剂：

高良姜素(Gal, 纯度≥98%, 四川精萃天成药物科技有限公司);乙型肝炎病毒(HBV)(上海佳和生物公司);AMPK抑制剂化合物C(compound C)(MCE公司);拉米夫定(吉斯凯制药有限公司);总胆红素(total bilirubin, TBIL)试剂盒(宁波赛克生物技术有限公司);TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(上海康朗生物科技有限公司);大鼠单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA试剂盒(钰博生物科技有限公司);兔源一抗天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、SIRT1、p-AMPK、GAPDH、AMPK及二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：

将大鼠随机分为对照组、乙肝组[5](Hepatitis B,尾静脉注射1×106pfu/mL HBV,剂量为10 mL/kg, 每7 d注射1次，共注射3次)、Gal低高剂量干预乙肝组[2](Gal-L、Gal-H,分别腹腔注射8.33、33.32 mg/kg Gal)、阳性药干预乙肝组[6](拉米夫定，灌胃10 mg/kg 拉米夫定)、Gal-H+compound C干预乙肝组[3](Gal-H+compound C,腹腔注射33.32 mg/kg Gal和10 mg/kg compound C),每组12只。造模后给药1次/d, 持续8周。该实验操作在生物安全实验室中完成。

1.2.2 检测血清中谷草转氨酶(aspartate aminot ransferase, AST)、TBIL、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)水平：

末次处理24 h后，麻醉所有大鼠并取大鼠腹主动脉血，以3 000 r/min离心15 min, 抽吸血清样品，通过全自动生化检测仪检测血清中AST、ALT水平，TBIL试剂盒检测血清中TBIL水平。

1.2.3 HE染色检测肝组织的病理：

每组随机抽取6只大鼠，麻醉并处死大鼠，取大鼠肝组织，用4%甲醛固定组织并用常规石蜡包埋，取5 μm厚的切片，经HE染色后，在光学显微镜下进行形态学观察，分析组织病理学的变化，并对病理图进行凋亡和坏死组织面积半定量分析。肝组织损伤(%)=视野中肝损伤面积/视野中肝总面积×100%。

1.2.4 TUNEL染色检测肝组织的细胞凋亡：

组织切片脱蜡、水化并用蛋白酶K处理30 min。切片最初用3%过氧化氢孵育15 min。随后，切片与TUNEL反应混合物在37 ℃下孵育60 min, 然后用DAPI孵育5 min。荧光显微镜下观察TUNEL阳性细胞。

1.2.5 染色质免疫共沉淀检测肝组织中HBV载量：

用37%甲醛固定切成小块的肝组织15 min, 再用甘氨酸终止交联。取肝组织小块经超声破碎后，将其与兔IgG抗体进行交联蛋白质/DNA的免疫沉淀，清洗上述混合体系，反转交联的蛋白质/DNA复合物以游离DNA,通过PCR扩增游离DNA中的HBV DNA片段，以HBV DNA表达量作为衡量HBV载量的标准。引物为[7]:R:5′-AAGATAGGGCATGGCAGC-3′,F:5′-AGAATCATCCTGGTCTGAGACAA-3′。

1.2.6 ELISA检测肝组织中MCP-1、IL-12、TNF-α水平：

取大鼠肝组织，将组织匀浆后根据ELISA试剂盒说明检测肝组织匀浆中MCP-1、IL-12、TNF-α水平。

1.2.7 Western blot检测肝组织中caspase-3、Bax、p-AMPK、SIRT1蛋白表达：

用RIPA裂解液提取组织的总蛋白。蛋白的浓度通过BCA法测定。将40 μg蛋白质加入到10% SDS-PAGE凝胶中，在80 V的恒定电压下通过电泳分离，然后转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭膜2 h。将一抗caspase-3(1∶2 000)、Bax(1∶5 000)、p-AMPK(1∶6 000)SIRT1(1∶4 000)、GAPDH(1∶2 000)、AMPK(1∶3 000)在4 ℃下孵育过夜，用二抗(1∶5 000)处理PVDF膜，并在室温下孵育2 h。将膜浸泡在显影液中可视化蛋白，ImageJ定量蛋白质灰度值。

1.3 统计学分析

GraphPad Prism 8.0用于统计分析。数据均以均数±标准差

表示。单因素方差分析和事后SNK-q检验用于组间差异的分析。

2、结果

2.1 Gal改善乙肝大鼠肝功能

乙肝组AST、TBIL、ALT水平高于对照组(P<0.05);Gal-L组、Gal-H组、拉米夫定组AST、TBIL、ALT水平低于乙肝组(P<0.05);Gal-H+compound C组AST、TBIL、ALT水平高于Gal-H组(P<0.05)(表1)。

表1 大鼠血清中AST、TBIL、ALT水平比较

2.2 Gal改善乙肝大鼠肝损伤

对照组、乙肝组、Gal-L组、Gal-H组、拉米夫定组、Gal-H+compound C组大鼠的肝组织损伤依次为：(0.00±0.00)%、(43.36±2.15)%、(31.16±1.45)%、(10.28±0.51)%、(10.83±0.43)%、(17.75±0.65)%。对照组大鼠肝组织结构无明显异常；乙肝组大鼠肝脏受到严重损伤，表现为中央静脉周围的炎性反应浸润和大面积小叶中心坏死和肝细胞凋亡；与乙肝组比较，Gal-L组、Gal-H组、拉米夫定组大鼠肝脏损伤减轻；与Gal-H组比较，Gal-H+compound C组大鼠肝脏损伤程度进一步加深(图1)。

2.3 Gal抑制乙肝大鼠肝组织中细胞凋亡

乙肝组细胞凋亡率高于对照组(P<0.05);Gal-L组、Gal-H组、拉米夫定组细胞凋亡率低于乙肝组(P<0.05);Gal-H+compound C组细胞凋亡率高于Gal-H组(P<0.05)(图2,表2)。

2.4 Gal抑制乙肝大鼠肝组织中HBV病毒载量

乙肝组HBV病毒载量高于对照组(P<0.05);Gal-L组、Gal-H组、拉米夫定组HBV病毒载量低于乙肝组(P<0.05);Gal-H+compound C组HBV病毒载量高于Gal-H组(P<0.05)(表2)。

2.5 Gal抑制乙肝大鼠肝组织中炎性反应

乙肝组MCP-1、IL-12、TNF-α水平高于对照组(P<0.05); Gal-L组、 Gal-H组、拉米夫定组MCP-1、IL-12、TNF-α水平低于乙肝组(P<0.05);Gal-H+compound C组MCP-1、IL-12、TNF-α水平高于Gal-H组(P<0.05)(表3)。

图1 肝组织HE染色检测代表性结果

图2 肝组织TUNEL染色检测结果

2.6 Gal抑制乙肝大鼠肝组织中caspase-3、Bax蛋白并激活AMPK/SIRT1通路关键蛋白质表达

与对照组相比，乙肝组caspase-3、Bax蛋白上调，p-AMPK、SIRT1蛋白下调(P<0.05);与乙肝组相比，Gal-L组、Gal-H组、拉米夫定组caspase-3、Bax蛋白下调，p-AMPK、SIRT1蛋白上调(P<0.05);与Gal-H组相比，Gal-H+compound C组caspase-3、Bax蛋白上调，p-AMPK、SIRT1蛋白下调(P<0.05)(图3)。

表2 大鼠肝组织中细胞凋亡率和HBV病毒载量比较

表3 大鼠肝组织中MCP-1、IL-12、TNF-α水平比

图3 大鼠肝组织中caspase-3、Bax、p-AMPK、SIRT1蛋白表达的Western blot检测

3、讨论

目前HBV感染的治疗方法都不能根除病毒，且药物副作用较大[8]。因此，为HBV感染患者开发新的治疗策略至关重要。本研究首先通过尾静脉注射HBV的方法构建了乙肝模型大鼠，结果表明乙肝大鼠肝功能异常且肝损伤严重，符合乙肝的特征。MCP-1、IL-12、TNF-α是HBV调控的主要炎性介质，其可诱导肝细胞变性和坏死，导致肝功能受损，引起肝损伤[9];除了炎性反应外，HBV还可触发肝细胞凋亡并诱导肝损伤[10];此外，caspase-3、Bax表达高低与细胞凋亡程度成正比。本研究证实了乙肝大鼠肝组织中存在炎性反应以及细胞大量凋亡。最后也证实了乙肝大鼠肝组织中HBV载量高。以上结果提示抑制炎性反应及细胞凋亡可能是减轻乙肝过程中肝损伤的有效途径之一。

Gal是一种天然黄酮醇，具有很强的抑制细胞凋亡和炎性反应的能力[11]。据报道，Gal可改善缺血/再灌注小鼠肝组织的病理损伤[12];Gal可减轻甲氨蝶呤肝毒性大鼠模型中的炎性反应和细胞凋亡[13]。本实验发现，低、高剂量Gal均可抑制乙肝大鼠肝组织中炎性反应、细胞凋亡以及HBV复制，且高剂量Gal的抑制效果优于低剂量Gal, 提示Gal可能成为治疗乙肝的潜在有效药物之一。

AMPK和SIRT1的激活是相互依存的，在调节脂质代谢和保肝方面具有协同作用。先前的研究阐明，激活AMPK/SIRT1通路改善了对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤[14];AMPK/SIRT1通路的上调减轻了非酒精性脂肪性肝病小鼠的肝脏炎性反应[15]。表明AMPK/SIRT1通路的激活在多种疾病中发挥着肝脏保护作用。在本实验中，低、高剂量Gal均可促进乙肝大鼠肝组织中p-AMPK、SIRT1蛋白表达，且高剂量Gal的促进效果优于低剂量Gal, 这促使笔者推测Gal抑制乙肝大鼠炎性反应、细胞凋亡以及HBV病毒复制的机制是否与上调AMPK/SIRT1通路有关。为了探究上述推测是否与实际情况相同，本实验用AMPK抑制剂compound C和高剂量Gal同时处理乙肝大鼠，结果表明compound C减弱了高剂量Gal对乙肝大鼠的保护作用，证明了推测是与实际情况相同的。

综上所述，Gal抑制乙肝大鼠炎性反应、细胞凋亡以及HBV病毒复制的机制可能与上调AMPK/SIRT1通路有关。该研究可能未乙肝的治疗提供新的理论依据。

参考文献:

[3]刘文晶,孙世杰,韩冰,等.槲皮素调节AMPK/SIRT1/NF-κB通路对乙型肝炎大鼠肝组织损伤的影响[J].现代生物医学进展,2023,23:624-629.

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[6]王秀芳,孙瑞青,邓娟.吴茱萸碱对乙型肝炎大鼠肝损伤的影响及其机制[J].山西医科大学学报,2023,54:785-790.

[7]李华龙,蔡楠,张蕾,等.基于PD-1/PD-L1信号通路观察丹参川芎嗪对乙型病毒性肝炎模型大鼠肝功能的保护作用[J].中药材,2020,43:2548-2553.

[8]何邵波,伍美兰,李小民,等.乙型肝炎病毒感染小鼠肝组织视黄醇结合蛋白4表达降低[J].基础医学与临床,2019,39:1277-1282.

基金资助:河北省2024年度医学科学研究课题计划(20241127);

文章来源:王维,穆宝龙,张文双,等.高良姜素减轻乙型病毒性肝炎模型大鼠的炎性反应[J].基础医学与临床,2024,44(11):1551-1556.