布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton tyrosine kinase, BTK)是B细胞受体信号转导的关键激酶，在恶性血液病中广泛表达[1]。BTK在B细胞发育和功能中的重要作用使其成为许多血液系统恶性肿瘤治疗的靶点[2]。BTK抑制剂——依鲁替尼(ibrutinib)通过抑制B细胞信号的激活，减少B细胞恶性增殖并诱导其凋亡，已被批准用于套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL)的治疗[3]。除了在血液系统恶性肿瘤中的应用，研究还发现依鲁替尼能够抑制人巨噬细胞结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的生长，并降低MTB感染后小鼠淋巴结和脾脏中的荷菌量，提示其具有作为抗结核靶向药物的潜力[4]。

奥布替尼(orelabrutinib)是我国首创的新型BTK抑制剂，通过分子结构的优化，提高了BTK激酶的抑制性和选择性[5-6]。这种优化包括更小的空间夹角和更匹配BTK活性中心的三维结构，通过采用单环母核结构，减少了铰链区氢键结合位点，降低了与其他激酶结合的可能性[7]。这些结构上的改进确保了奥布替尼具有最佳的激酶选择性，降低了脱靶效应，使其在治疗中的疗效和安全性得到了显著提升[8]。

目前，奥布替尼已被证实在临床复发和难治性边缘区淋巴瘤患者中有效且可耐受[8],但其对巨噬细胞吞噬和清除MTB的作用还未见报道。考虑到BTK在巨噬细胞功能调节中的重要作用[9-10],探索奥布替尼在MTB感染宿主巨噬细胞中的免疫调控作用具有重要的科学意义和临床应用潜力。因此，本研究旨在探讨奥布替尼在MTB感染宿主巨噬细胞中的免疫调控作用，以期为开发新型抗结核治疗药物提供理论基础和实验依据。

1、材料和方法

一、研究材料

细胞培养基RPMI 1640(美国赛默飞世尔科技公司)、胎牛血清(美国赛默飞世尔科技公司)、RIPA裂解液(北京索莱宝科技有限公司)、中性罗氏固体培养基(珠海贝索生物技术有限公司)、Cocktail蛋白酶抑制剂药片(瑞士霍夫曼罗氏有限责任公司)、蛋白磷酸酶抑制剂(北京索莱宝科技有限公司)、12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA;美国Sigma-Aldrich®公司)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)、Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(美国赛默飞世尔科技公司)、BTK (D3H5)兔单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)、Phspho-BTK (TYR 223)兔单克隆抗体[艾博抗(上海)贸易有限公司]、β-actin小鼠单克隆抗体(美国Sigma-Aldrich®公司)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO;北京索莱宝科技有限公司)、Muse凋亡试剂盒(德国默克集团)、奥布替尼(美国Selleck生物科技有限公司)、7H10粉(美国贝克顿-迪金森公司)、人急性单核白血病细胞(human acute monocytic leukemia cells, THP-1;中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)、磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline, PBS;武汉赛维尔生物科技有限公司)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS;北京索莱宝科技有限公司)、耻垢分枝杆菌(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)、庆大霉素(北京索莱宝科技有限公司)、siRNA(美国赛默飞世尔科技公司)。

二、研究方法

1.THP-1细胞培养、诱导分化及感染：

THP-1细胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中生长、扩增，并置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养。取对数生长期的细胞，以5×105个/孔接种至12孔细胞培养板中，每孔1 ml体系，并用100 ng/ml PMA诱导分化，过夜培养，观察细胞贴壁情况。取对数期生长的耻垢分枝杆菌感染THP-1细胞，以感染复数(multiplicity of infection, MOI)=10(细菌数∶细胞数=10∶1)感染，感染2 h后弃去上清，加入500μl PBS清洗细胞两次，随后加入含有庆大霉素(25μg/ml)的培养液1 ml继续培养24 h。

2.siRNA基因敲除：

siRNA和Lipofectamine RNAiMAX转染试剂在Opti-MEMTM减血清培养基中，制成混合液[siRNA终浓度50纳摩尔(nanomole, nM)]。12孔板每孔需要1 ml体系，每孔中有800μl含25μg/ml庆大霉素的培养液和200μl Opti-MEMTM(含2.5μl siRNA和6μl lipofectamine RNAiMAX)。3种试剂的具体用量根据实验操作决定。静置5～10 min后，逐滴加入细胞培养液上，转染后进行后续操作。

3.菌落形成单位(colony-forming unit, CFU)计数法：

使用0.05% SDS制备细胞裂解液，在步骤2完成后，去除12孔板中的培养液，加入1 ml/孔PBS,去除胞外细菌。去除每孔中的PBS溶液，加入1 ml/孔细胞裂解液。在每个孔中吹打几下，确保无贴壁细胞，再收至1.5 ml离心管中。用PBS进行10倍、100倍和1000倍梯度稀释，并以每培养板100μl菌液接种至7H10培养板中培养3 d后观察计数。

4.蛋白免疫印迹分析：

使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA溶液收集蛋白：去除细胞培养液，用PBS液洗一遍。按照6孔板每孔细胞量加入150～250μl裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。将裂解后的样品以(10 000～14 000)×g离心3～5 min,取上清。通过BCA蛋白定量后，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),并转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF),在5%脱脂奶粉的封闭液中封闭1～1.5 h,并于4℃摇床上孵育一抗过夜，Tris缓冲盐溶液(tris buffered saline, TBS)洗去一抗，加入二抗孵育1～2 h, TBS洗去二抗，加入化学发光底物(electrogenerated chemiluminescence, ECL)超敏发光液进行显色。

5.Muse细胞凋亡实验：

细胞处理结束后，用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)胰蛋白酶溶液消化贴壁的细胞2 min,等观察到有磨砂样的细胞团滑落或显微镜下大多数细胞由贴壁状态变为悬浮状态时，加入1 ml RPIM 1640完全培养液终止消化，收集细胞悬液，并于300×g离心5 min,弃上清。用1 ml RPIM 1640完全培养液重悬细胞，取100μl细胞悬液加入100μl的MuseTMAnnexin V死细胞试剂(MuseTMAnnexin V& Dead Cell Reagent),室温孵育20 min。孵育结束后使用MuseTM仪器进行凋亡检测。

三、统计学处理

使用Graphpad 9.4.1软件进行数据处理及统计分析。本研究数据为偏态分布计量数据，以“中位数(四分位数)[M(Q1,Q3)]”描述，采用Mann WhitneyU检验进行组间差异的比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

一、奥布替尼抑制BTK酪氨酸磷酸化

用0.01、0.1、1和10μmol奥布替尼处理THP-1细胞24 h,以DMSO处理组为对照，通过Muse细胞计数仪及其配套的凋亡试剂盒检测巨噬细胞的生存率。通过上述凋亡实验证实奥布替尼并不影响巨噬细胞的生存率(图1)。随后利用奥布替尼处理已诱导分化的THP-1细胞，相较于DMSO处理组，1μmol和10μmol的奥布替尼处理组均能明显抑制BTK蛋白的酪氨酸磷酸化而并不改变BTK蛋白表达量(U=2.000,P=0.200)。见图2。

图1不同浓度奥布替尼处理人急性单核白血病细胞的凋亡实验结果

图2不同浓度奥布替尼抑制布鲁顿酪氨酸激酶磷酸化结果

二、奥布替尼增强巨噬细胞对耻垢分枝杆菌的清除

建立耻垢分枝杆菌感染巨噬细胞模型，对比奥布替尼处理组和DMSO处理组(对照组)的巨噬细胞对耻垢分枝杆菌的清除作用。发现用0.1、1和10μmol奥布替尼处理的巨噬细胞，其菌落数分别为96.5(84.8～111.3)×103个/ml、95.0(92.3～100.8)×103个/ml和59.0(55.8～65.3)×103个/ml,与对照组的菌落数[130.0(120.3～137.5)×103个/ml]相比，差异有统计学意义(U=0.000,P=0.014)。用0.01μmol奥布替尼处理的巨噬细胞，其菌落数[149.0(142.0～152.3)×103个/ml]与对照组相比差异无统计学意义(U=0.500,P=0.057)。见图3。

图3奥布替尼增强巨噬细胞对耻垢分枝杆菌的清除作用

图4BTK siRNA抑制BTK蛋白的表达

三、敲低BTK蛋白表达增强巨噬细胞对细菌的清除

利用siRNA干扰技术敲低BTK蛋白表达水平，通过蛋白印记对比不同转染时间下BTK蛋白的表达水平，证实在转染48 h和72 h时能明显抑制BTK的蛋白表达(图4)。随后建立耻垢分枝杆菌的细胞感染模型，通过CFU计数实验检测感染2 h和感染24 h后的胞内载菌量。感染2 h后，对照组与BTK敲减组胞内细菌数分别为23.0(8.0～28.0)×103个/ml和23.0(11.0～30.0)×103个/ml,两组间差异无统计学意义(U=32.500,P=0.250)。感染24 h后，对照组与BTK敲减组胞内细菌数分别为52.0(44.0～61.5)×103个/ml和25.0(22.0～28.0)×103个/ml,两组间差异有统计学意义(U=9.000,P=0.002)。见图5。

图5敲减BTK增强巨噬细胞对耻垢分枝杆菌的清除作用

注人急性单核白血病细胞分别转染对照siRNA(对照组)和BTK siRNA(BTK敲减组),菌落形成单位计数实验检测耻垢分枝杆菌感染2 h和24 h后的胞内载菌量。BTK敲减组与对照组相比，ns:差异无统计学意义；a:P<0.01

3、讨 论

PTK是一类能够催化三磷酸腺苷上γ-磷酸转移到底物蛋白酪氨酸残基的酶，能磷酸化信号通路中关键分子的酪氨酸残基，其基本功能对于维持正常的细胞生长和分化至关重要[11]。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)是专门针对异常PTK的靶向抑制剂，它们作为三磷酸腺苷的竞争性同类，通过占据PTK的三磷酸腺苷结合位点，阻断PTK介导的信号通路，从而抑制癌细胞的生长和增殖。与传统化疗药物相比，TKI具有高效、低毒和高特异性的显著优势[12]。PTK和TKI在抗结核治疗中的潜在作用已引起关注。Korbee等[13]研究发现，通过靶向受体酪氨酸激酶化合物，可以抑制宿主内相关的信号通路，有效地抑制了MTB和沙门菌的生存，证明了相关激酶在宿主控制MTB中的作用。此外，Sogi等[14]研究了TKI吉非替尼对MTB感染巨噬细胞的功能影响，借助磷酸蛋白质学和转录组分析，发现吉非替尼处理可影响STAT3信号通路，从而抑制体内的抗MTB免疫反应，并增加与溶酶体形成和功能相关基因的表达，增强细菌对溶酶体的靶向性，抑制MTB的胞内存活。这些研究表明，以抗肿瘤为研发背景的TKI有可能成为宿主导向的抗结核候选药物。

结核病目前主要通过联合使用多种一线抗结核药物进行治疗。这些一线药物包括异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺，通常需要持续6～9个月的治疗周期[15]。尽管这些药物在过去几十年中明显降低了结核病的发病率和病亡率，但耐药结核病，特别是耐多药结核病和广泛耐药结核病的出现和传播，使得治疗难度大幅增加[16]。

耐药结核病的治疗依赖二线抗结核药物，如氟喹诺酮类和氨基糖苷类，这些药物的治疗周期更长、毒性更大、不良反应更多，且治疗费用昂贵，大幅增加患者负担[17-18]。现有药物对潜伏感染和细胞内存活的MTB效果有限，难以完全清除病原菌，增加了复发和传播的风险。

因此，寻找和开发新型抗结核药物至关重要。以宿主为靶向、适当地调节宿主免疫反应，从而增强宿主抗病原微生物活性和降低过度炎症反应的治疗方法，能够最大程度减轻患者在传统治疗过程中对身体造成的损伤[19-20]。巨噬细胞在宿主防御MTB中发挥关键作用，因此，调控巨噬细胞的功能是宿主导向治疗策略的优先选择靶点。

新型药物应针对现有药物之外的新靶点，减少交叉耐药的可能性。同时，新药需要具备更强的杀菌活性和更好的细胞穿透能力，特别是针对胞内和肉芽组织中的MTB。此外，新药物应优化其药代动力学和药效学特性，缩短治疗周期，减少不良反应，以提高患者的治疗依从性。最后，考虑到结核病在发展中国家的高发病率，新药物应具有一定的可负担性和可获取性，确保其能够在资源有限的地区广泛应用。

BTK在调节免疫细胞功能方面的作用逐渐被关注与研究[21-22]。依鲁替尼是首个获批用于治疗B细胞相关的恶性肿瘤的BTK抑制剂[23-24],通过诱导巨噬细胞自噬，从而抑制细胞内MTB生长[4, 25],提示依鲁替尼具有促进巨噬细胞抗结核的免疫功能。

本研究探讨了新型BTK抑制剂奥布替尼在MTB感染宿主巨噬细胞中的免疫调控作用，发现其不仅能够抑制BTK酪氨酸磷酸化，还明显增强了巨噬细胞对非致病性分枝杆菌(耻垢分枝杆菌)的清除能力。通过siRNA干扰技术进一步验证了BTK的关键作用，发现BTK的抑制有助于提高巨噬细胞的抗菌效能。这一发现为奥布替尼可能适用于抗结核治疗提供了新的思路。但这项研究有这几个明显的局限性，首先，本研究仅在体外细胞水平上进行了实验，缺乏体内动物模型的验证，无法全面评估奥布替尼在生物体内的抗结核效果和安全性。此外，以耻垢分枝杆菌而非MTB为实验模型，研究BTK抑制剂影响巨噬细胞细菌吞噬作用，尽管耻垢分枝杆菌与MTB都是分枝杆菌属成员，具有相似的细胞壁结构和某些代谢途径及毒力基因[26],但他们免疫原性的差异可能对细菌吞噬的评估产生负面影响，而使用MTB的实验模型结果与人类疾病具有更大的相关性。由于耻垢分枝杆菌又具有非致病性、快速生长、基因操作相对容易等特性，使得其成为研究MTB基因功能和致病机制的理想替代菌株[27-28],但仍需建立MTB感染的细胞模型进行验证。最后，BTK在巨噬细胞功能中的具体作用机制尚不完全清楚，需要进一步深入研究以揭示其分子机制及其信号通路。

综上所述，BTK及其磷酸化在MTB感染巨噬细胞中的作用值得进一步研究，BTK抑制剂奥布替尼作为宿主导向的抗结核药物具有潜力，但需要更多的体内实验验证其治疗价值。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献王艺霖：实验设计、数据分析和文章撰写；吴潇：实验实施、数据采集和数据分析；逄宇和李姗姗：实验设计

参考文献:

[7]中国临床肿瘤学会(CSCO)淋巴瘤专家委员会.奥布替尼治疗B细胞淋巴瘤中国专家推荐临床应用指导原则(2021年版).白血病·淋巴瘤,2021,30(8):455-460.

基金资助:国家自然科学基金(82202530);北京市科技新星计划创新新星(20220484169､20230484295)~~;

文章来源:王艺霖,吴潇,逄宇,等.奥布替尼在分枝杆菌感染宿主巨噬细胞中的免疫调控作用[J].中国防痨杂志,2024,46(09):1063-1068.