随着糖尿病患者的不断增加，糖尿病冠心病在中国的发病率呈急速上升趋势，据估计，全球糖尿病患病率将从2017年的4.25亿例增加至2045年的6.29亿例，而超50%的患者将死于心血管事件，特别是冠状动脉疾病[1]。

氧化三甲胺（TMAO）是膳食三甲胺（主要为胆碱及肉碱）的肠道微生物-宿主代谢产物，因其对动脉粥样硬化及心血管疾病（coronaryheartdisease,CHD）的潜在不良影响而备受关注。研究表明，TMAO通过抑制胆固醇逆转运，激活巨噬细胞，增加血小板活性及血栓形成来促进小鼠动脉粥样硬化，而抑制TMAO的产生可减少动脉粥样硬化病变的形成[2]。另外，在糖尿病纳入人群中发现TMAO-CHD关联，在非糖尿病纳入者中无关联，表明升高的TMAO可能是高血糖引起的，且会导致CHD，但对其具体机制并不清楚。另外，TMAO被发现有明显的促炎能力，其可引起内皮细胞上清液IL-1β水平明显升高[3]；且在体内外均能促进NOD样受体家族3(NOD-likereceptorfamily3,NLRP3）的表达，激活胱天蛋白酶-1(Caspase-1)[4]。

细胞焦亡是近年来发现并证实的一种依赖于Caspase-1并伴有大量促炎症因子释放的新的程序性细胞死亡方式。NLRP3炎性小体通过诱导接头蛋白（theapoptoticspeck-likeproteincontainingacaspaserecruitmentdomain,ASC）聚集使Caspase-1活化，Caspase-1通过非典型的（内质网）释放途径诱导促炎性细胞因子IL-1β及IL-18的成熟和释放[5]。有研究表明，细胞焦亡广泛参与动脉粥样硬化性疾病的发生发展，并起重要作用[6]。

本研究探讨TMAO对体外培养的大鼠心肌细胞H9c2(2-1）中NLRP3炎性体表达和细胞焦亡水平的影响，以阐述糖尿病冠心病的发病机制，为糖尿病冠心病的防治研究寻找新的分子靶点及作用通路。

1、材料与方法

1.1细胞

大鼠心肌细胞H9c2(2-1）购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。

1.2主要试剂

TMAO购自美国Sigma公司；β-actin抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG及HRP标记的山羊抗鼠IgG均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；蛋白磷酸酶抑制剂混合物、RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂PMSF及BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自北京索莱宝生物科技有限公司；NLRP3抑制剂MCC950购自美国MCE公司；CCK-8试剂购自日本株式会社同仁化学研究所；RNAisoPlus、PrimeScript试剂盒及TBGreen试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自德国PAN公司；兔抗大鼠NLRP3抗体及鼠抗大鼠IL-1β抗体购自美国Proteintech公司；鼠抗大鼠Caspase-1抗体购自美国GeneTex公司；Caspase-1直标抗体购自美国Santa公司；碘化丙啶（propidiumiodide,PI）试剂盒购自美国BD公司。

1.3大鼠心肌细胞处理

将H9c2(2-1）细胞接种至25cm2培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃，5%CO2,93%湿度细胞培养箱中24h，转至96孔板中，200μL/孔，约4×103个细胞，2d换液1次。

1.4TMAO处理H9c2(2-1）细胞浓度的筛选

采用CCK-8法。将1.3项培养的H9c2(2-1）细胞使用前经饥饿处理12h，分别使用含50、100、300、500、1000、3000及5000μmol/L的TMAO处理24、48及72h，以未处理的细胞为对照组，含CCK-8溶液的培养基为空白组。检测各组细胞的A450值，按下式计算细胞存活率。筛选对细胞生存率有影响但不会对细胞造成损伤的最大TMAO浓度进行后续试验。

细胞存活率（%）=[（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）]×100%

1.5TMAO对H9c2(2-1）细胞中NLRP3炎性体诱导因子释放及细胞焦亡影响的检测

将培养至2×105个/mL的H9c2(2-1）细胞用1.4项筛选的最适TMAO浓度（TMAO组）分别处理24、48及72h，以未处理的细胞为对照组。

1.5.1H9c2(2-1）细胞中NLRP3、IL-1β及Caspase-1mRNA转录水平的检测

采用RT-PCR。按RNAisoPlus、PrimeScript试剂盒及TBGreen试剂盒说明书提取各组H9c2(2-1）细胞总RNA，测定RNA浓度，将其反转录合成cDNA，以其为模板，PCR扩增相应炎性因子NLRP3、IL-1β及Caspase-1，引物序列见表1。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。反应条件为：95℃30s,95℃5s,60℃30s,95℃5s,60℃30s,95℃15s，共40个循环。以GAPDH作为内参照，采用2-△△Ct对各基因进行定量分析。试验重复3次。

表1各炎性因子的引物序列

1.5.2H9c2(2-1）细胞中NLRP3、IL-1β及Caspase-1蛋白表达水平的检测

采用Westernblot。用RIPA蛋白裂解液及PMSF试剂提取各组细胞中NLRP3、IL-1β及Caspase-1蛋白，分别经10%SDS-PAGE分离后，电转至PVDF膜，室温封闭约2h；分别加入β-actin抗体（1∶1000稀释）、兔抗大鼠NLRP3抗体（1∶300稀释）、鼠抗大鼠IL-1β抗体（1∶500稀释）及鼠抗大鼠Caspase-1抗体（0.5μg/mL),4℃孵育过夜；洗涤4次，每次8min，分别加入山羊抗兔IgG(1∶8000稀释）及山羊抗鼠IgG(1∶8000稀释），常温孵育约2h；洗涤4次，每次8min，进行图像曝光及定量分析。试验重复3次。

1.5.3H9c2(2-1）细胞焦亡水平的检测

采用流式细胞术。Caspase-1直标抗体标记Caspase-1阳性（Caspase-1+）细胞，PI染色试剂盒标记PI阳性（PI+）细胞。统计Caspase-1+PI+细胞数并确定细胞焦亡发生的时间点。

1.6NLRP3抑制剂MCC950对H9c2(2-1）细胞中NLRP3炎性体诱导因子释放及细胞焦亡影响的检测

为验证TMAO对H9c2(2-1）细胞焦亡的影响，参考文献[7]，将培养至2×105个/mL的H9c2(2-1）细胞分为TMAO组（300μmol/LTMAO）、抑制剂组（0.1μmol/LMCC950）、TMAO+抑制剂组（300μmol/LTMAO+0.1μmol/LMCC950）及对照组。各组细胞处理至筛选的细胞焦亡时间点，分别采用1.5.1、1.5.2及1.5.3项方法检测加入抑制剂后各组细胞相关指标的变化情况。

1.7统计学分析

使用SPSS22.0及GraphpadPrism6.0软件进行统计学分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析及LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1H9c2(2-1）细胞的生存率

结果显示，与对照组比较，500、1000、3000及5000μmol/LTMAO处理的H9c2(2-1）细胞生存率均显著下降（t分别为27.8361、19.2977、67.4484和24.4169,P<0.01），且存在一定的浓度及时间依赖性；50、100、300μmol/LTMAO处理组细胞生存率差异均无统计学意义（t分别为0.873472、0.807265和4.09374,P>0.05），表明在此浓度范围内TMAO对细胞生存率影响不大。见表2。选择300μmol/LTMAO处理细胞。

表2不同浓度TMAO处理H9c2(2-1）细胞的生存率

2.2TMAO对H9c2(2-1）细胞中NLRP3炎性体诱导因子释放及细胞焦亡的影响

2.2.1各组细胞中NLRP3mRNA转录及蛋白表达水平

结果显示，与对照组比较，TMAO组处理48及72h，细胞中NLRP3mRNA转录及蛋白表达水平均显著升高（mRNA:t分别为7.22028和9.7155，蛋白：t分别为10.8264和22.7221,P均<0.05），且呈时间依赖性，处理时间越长，细胞中NLRP3水平越高，见图1～3。

图1各组细胞中NLRP3基因mRNA的转录水平

图2各组细胞中NLRP3蛋白表达水平的Westernblot检测

图3各组细胞中NLRP3蛋白的表达水平

2.2.2各组细胞中IL-1β及Caspase-1mRNA转录及蛋白表达水平

结果显示，与对照组比较，TMAO组处理48及72h，细胞中IL-1β及Caspase-1mRNA转录和蛋白水平均显著升高（IL-1βmRNA:t分别为41.6159和23.9869,Caspase-1mRNA:t分别为12.3354和29.2948;IL-1β蛋白：t分别为14.2134和25.1523,Caspase-1蛋白：t分别为8.3112和16.9575。P均<0.01），细胞中Caspase-1水平呈时间依赖性。见图4～6。

图4各组细胞中IL-1β（A）及Caspase-1(B)mRNA的转录水平

图5各组细胞中IL-1β及Caspase-1蛋白表达水平的Westernblot检测

图6各组细胞中IL-1β（A）及Caspase-1(B）蛋白的表达水平

2.2.3各组细胞的焦亡水平

结果显示，与对照组比较，TMAO组处理24h的细胞中NLRP3炎性体诱导的焦亡细胞（Caspase-1+PI+）数差异无统计学意义（t=1.797,P>0.05），处理48及72h，焦亡细胞数显著增加（t分别为10.1373和17.4577,P均<0.01），见图7。以TMAO处理48h为细胞焦亡发生时间。

图7各组细胞中焦亡细胞数

2.3NLRP3抑制剂MCC950对H9c2(2-1）细胞焦亡的影响

2.3.1各组细胞中NLRP3mRNA转录及蛋白表达水平

结果显示，与对照组比较，抑制剂组细胞中NLRP3炎性体mRNA转录及蛋白表达水平均显著下降（t分别为15.866和5.53189,P均<0.05）；与TMAO组比较，TMAO组+抑制剂组细胞中NLRP3炎性体mRNA转录及蛋白表达水平均显著下降（t分别为19.8269和6.41838,P均<0.05）。见图8～10。

图8各组细胞中NLRP3mRNA的转录水平

图9各组细胞中NLRP3蛋白表达水平的Westernblot检测

2.3.2各组细胞中IL-1β及Caspase-1mRNA转录及蛋白表达水平

结果显示，与对照组比较，抑制剂组细胞中IL-1β及Caspase-1mRNA转录和蛋白表达水平均显著下降（mRNA:t分别为5.00552和3.75501，蛋白：t分别为4.88896和18.506,P均<0.05）；与TMAO组比较，TMAO+抑制剂组细胞中IL-1β及Caspase-1mRNA转录和蛋白表达水平均显著下降（mRNA:t分别为41.8357和4.02117；蛋白：t分别为4.00624和8.54427,P均<0.05）。见图11～13。

2.3.3各组细胞的焦亡水平

结果显示，与对照组比较，抑制剂组细胞焦亡水平显著下降（t=2.948,P<0.05）；与TMAO组比较，TMAO+抑制剂组细胞焦亡水平显著下降（t=6.52833,P<0.05），见图14。表明减少NLRP3炎性体的表达，可显著抑制TMAO诱导的细胞焦亡及炎症反应。

图10各组细胞中NLRP3蛋白的表达水平

图11各组细胞中Caspase-1及IL-1βmRNA的转录水平

图12各组细胞中Caspase-1及IL-1β蛋白表达水平的Westernblot检测

图13各组细胞中Caspase-1及IL-1β蛋白的表达水平

图14各组细胞中焦亡细胞数

3、讨论

TMAO来自营养前体（胆碱、磷脂酰胆碱及左旋肉碱）的血浆代谢物，由肠道微生物群产生。研究表明，肠道微生物参与了心血管疾病的发病机制[8,9]。对于血浆TMAO水平与心血管风险之间的关系，有研究表明，TMAO血浆水平升高与主要不良心脏事件的发生风险相关，与传统危险因素无关[10]；高TMAO水平预示心脏病患者长期的不良临床结局[11]；血浆TMAO水平是冠心病患者高动脉粥样硬化负担的独立预测因子[12]；另外，糖尿病与较高的TMAO血浆水平相关[13]。但TMAO水平与2型糖尿病（type2diabeticmellitus,T2DM）患者患CHD风险的关系尚未得到证实。因此，合理的假设是TMAO的循环水平可预测及诱发T2DM患者CHD的事件风险，意味着饮食-肠道微生物-宿主相互作用在预防心血管疾病中的潜在应用，这可为预防DM-CHD提供新的思路和方法。

NLRP3炎性体在动脉粥样硬化炎症发生及发展中的作用已成为研究热点。在参与动脉粥样硬化过程的已被研究或正被研究的各种炎症标志物中，NLRP3炎性体最为重要。其激活可导致下游炎性细胞因子的激活，这些细胞因子在动脉粥样硬化进展的炎症中起重要作用[14]。本研究用TMAO处理H9c2(2-1）细胞48h开始，NLRP3炎性体水平显著增加（P<0.05），导致Caspase-1激活，促炎因子IL-1β表达水平显著上调（P<0.05）。

细胞焦亡是一种程序性细胞死亡方式，以Caspase-1激活为特征，可导致炎性细胞因子的广泛释放，目前的鉴定标志为Caspase-1和PI双阳性。本研究中，用含TMAO的培养基处理H9c2(2-1）细胞48h开始，NLRP3炎性体水平显著增加，Caspase-1激活，发生细胞焦亡，同时诱导重要促炎因子IL-1β表达水平明显上调，严重抑制细胞总体生长。随后实验中加入NLRP3抑制剂处理细胞，NLRP3表达的显著下调使细胞内促炎因子的表达水平下降，缓解细胞焦亡，提示TMAO引起的H9c2(2-1）损害与NLRP3炎性体介导的细胞焦亡密切相关。

综上所述，在体外以高浓度TMAO处理可引起H9c2(2-1）中NLRP3炎性体表达水平上调，细胞内炎症，导致出现细胞焦亡。当加入NLRP3抑制剂后，可显著改善由高浓度TMAO诱导的炎症反应及细胞焦亡。本研究为以抑制NLRP3炎症体治疗糖尿病冠心病的靶向治疗方案提供了体外实验的初步证据，为下一步的体内实验奠定了基础。

参考文献：

[1]费菲,翁建平.从2型糖尿病东西方差异找到控制血糖的最优策略[J].中国医药科学,2018,8(21):16-18.

[3]吴姗珊,许玲玲,黄伟青,等.丹参酮ⅡA对氧化三甲胺诱导人脐静脉内皮细胞炎症损伤的作用研究[J].中国临床实用医学,2019,10(2):52-56.

[7]彭菲菲,曾振国,邵强,等.MCC950能减轻线粒体损伤相关分子模式对肺泡巨噬细胞的致炎效应[J].中华危重病急救医学,2016(11):978-982.

李洁,李萍,李海霞,魏静,阎春生,哈小琴.NOD样受体家族3炎性体对氧化三甲胺诱导的大鼠心肌细胞焦亡的调控作用[J].中国生物制品学杂志,2020,33(06):619-625.