近年随着全球变暖逐年加重，极端高温天气持续时间变长，热射病全球发病率呈逐年增加趋势[1]。“劳力性热射病”(exertional heat stroke, EHS)多发生在夏季户外工作和运动训练的人群中，比如马拉松选手、士兵和消防员等，具有极高的致死率[2]。其特征为核心体温>40 ℃,并伴有中枢神经系统功能障碍，严重者进展为多器官功能损害[3]。肺作为呼吸和散射器官，在热射病早期易发生损伤，出现急性肺损伤(acute lung injury, ALI)或急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[2]。研究发现，60%的热射病患者会出现ALI[4]。

热打击可直接造成线粒体的损伤，诱导细胞凋亡[5]。因此有效清除受损线粒体，对减轻热射病器官损伤至关重要。受损、老化和发生功能障碍的线粒体可被特定的自噬小体识别，并选择性地运输到溶酶体使之降解，这一过程称为线粒体自噬。线粒体自噬包括Pink1(PTEN induced putative kinase 1, Pink 1)/Parkin、B淋巴细胞瘤/白血病-2(BCL-2)/E1B19000相互作用相似蛋白(BNIP3L)/NIX和FUNDCl(FUNl4 domain containing 1)等多条途径，线粒体自噬功能不全或异常与人类多种疾病相关[6]。但NIX在热射病肺损伤中的作用仍缺乏研究。雷帕霉素(rapamycin, Rapa)能够特异性抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的活性，增强自噬水平，从而保护器官或组织功能[7]。我们既往研究也证实，上调自噬可减轻热射病大鼠肺损伤[8]。因此本研究通过建立EHS大鼠模型，探讨雷帕霉素是否通过上调NIX,增强线粒体自噬，减轻EHS引起的ALI。

1、材料与方法

1.1 动物、仪器和试剂

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，体质量300～350 g, 8周龄，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物许可证编号：SCXK(鲁)2022-0006。动物饲养于解放军军事医学科学院动物实验室(SPF 等级),室内适度通风，光照12 h, 温度25～26 ℃,相对湿度为 50%～60%。实验动物相关方案获得解放军总医院第八医学中心动物伦理委员会批准(批准号为：30920241053501323)。

六道小动物跑台(XR-PT-10A,上海欣软信息科技有限公司)放置于透明模拟高温高湿环境实验舱中，该舱能精准控制舱内温度及湿度并维持恒定。大鼠肛温仪(型号为TH212,购自上海玉研科技仪器公司),灵敏度为0.1 ℃,精确度为≤±0.2 ℃。

雷帕霉素(规格25 mg)购自美国MCE 公司；兔抗大鼠微管相关蛋白1轻链 3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)多克隆抗体、兔抗大鼠磷酸甘油酸脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GADPH)多克隆抗体购自美国 CST 公司；兔抗大鼠NIX多克隆抗体、兔抗大鼠β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体以及小鼠抗大鼠Tom20单克隆抗体均购自英国 Abcam 公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；原位末端转移酶标记法(TUNEL)试剂盒购自瑞士 Roche 公司；甲酰胺购自上海麦克林生化科技有限公司；激光共聚焦显微镜系统(日本Olympus公司),凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 动物分组及模型构建

1.2.1 动物分组

60只健康雄性SD大鼠用随机数生成法随机分为四组：正常组(Ctrl)、雷帕霉素组(Rapa)、劳力性热射病组(EHS)和EHS+雷帕霉素干预组(EHS+Rapa),每组15只。雷帕霉素溶解于DMSO 溶液中，配成原液浓度为2 g/L。取15 μL 原液混合于聚山梨醇脂-20及生理盐水中，最终稀释为1.5 mL的工作液。建模前，Rapa组及EHS+Rapa组大鼠每天8:00以1 mg/(kg·d)的剂量腹腔注射雷帕霉素，对照组及 EHS 组大鼠在同一时间点给予同体积生理盐水腹腔注射，均注射4 d。

1.2.2 建模前劳力适应性训练

参照文献[9],建模前，实验大鼠均放入实验舱，在室温24～26 ℃下采用阶梯训练法进行适应性训练，周期为7 d。

1.2.3 EHS模型建立

EHS组和EHS+Rapa组大鼠热应激实验前禁食12 h, 饮水不限。大鼠在开始建模前30 min称质量并禁止饮水。当实验舱温度达到(39.5±0.3)℃,相对湿度为(55±5)%时，将大鼠放入跑台，以 5 m/min 的初始速度开始跑步(将坡度设为0),每隔2 min 增速 1 m/min, 20 min增速至 15 m/min 后保持恒定速度持续跑步，直到出现疲劳状态(适当驱赶后仍无法继续跑步)。实验全程严密观察大鼠意识、精神变化[9]。在大鼠达到 EHS诊断标准后，将其从热舱中取出，停止热暴露，称质量，室温下自然降温，继续监测大鼠精神状态至建模后5 h。EHS诊断标准为：①大鼠直肠温度≥41.0 ℃;②大鼠出现中枢神经系统功能障碍表现，即无自主活动时间>5 s(轻度无痛刺激不能驱赶动物爬行或改变位置，正位反射、角膜反射以及强烈疼痛刺激仍然存在)[10]。对照组和雷帕霉素组大鼠同样置于实验舱[温度为(25±0.3)℃,相对湿度为(30±5)%],两组大鼠均不给予热应激和跑步刺激，1 h后取出，室温下观察5 h。

1.3 监测大鼠核心温度变化

将肛温仪传感器均匀涂抹润滑剂后，插入大鼠肛门，深度约5～7 cm, 予以胶带固定在鼠尾。实时监测大鼠肛温，达到EHS诊断标准后，记录各组大鼠肛温。

1.4 大鼠动脉血气分析测定

在实验终点，以2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，动脉血气针经腹主动脉采血约0.5 mL,采用血气分析仪(Premier 3000,瑞士)测定氧分压(PaO2)和二氧化碳分压(PaCO2)。

1.5 大鼠肺血管通透性测定

各组取5只存活大鼠，参照既往文献[11],将伊文氏蓝(Evans blue, EB)溶液以2 mL/kg从大鼠尾静脉注射。1 h后用 PBS(10 mL)冲洗肺循环。沿肺动静脉根部剪断肺动静脉，分离并取出全肺组织。去除肺血管残端后，称质量后将全肺组织浸泡在5 mL甲酰胺溶液中(1 mL/100 mg),然后与甲酰胺在60 ℃ 16 h的条件下共孵化。移出肺组织，甲酰胺溶液于7 000 r/min离心，取上清液，测量吸光度(A620),并计算组织中的EB含量。

1.6 大鼠肺组织病理学观察

取左肺下叶组织，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水、常规石蜡包埋后切片，脱蜡后苏木精-伊红(hematoxylin eosin, HE)染色，封片后在光镜下观察肺组织病理改变。在光学显微镜下随机选取5个视野，参照 Hong等[12]的标准计算肺组织病理损伤评分。

1.7 TUNEL法观察大鼠肺组织凋亡

各组大鼠肺组织石蜡切片，经脱蜡、脱水、吹干，室温下封闭液封闭1 h。3%过氧化氢作用10 min后，PBS液清洗后，破膜、PBS液再清洗3次。按照 TUNEL 试剂盒说明要求进行TUNEL染色，DAPI染细胞核。光镜下观察，细胞核棕色为凋亡阳性，蓝色为正常细胞核。采用Image J图像分析，每张切片随机选取5个视野(×200),计算凋亡指数(apoptosis index)。凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数× 100%。

1.8 透射电镜下观察肺Ⅱ型上皮细胞中线粒体形态

取大鼠右下肺大小约1 mm×1 mm×1 mm的组织块， 2.5%戊二醛溶液固定，PBS漂洗3次。1%锇酸固定2 h, PBS冲洗3次。乙醇梯度脱水、包埋、切片，醋酸铀-枸橼酸铅(3%)双染色，透射电镜(JEM-1230)下采集图像并分析。

1.9 Western blot方法测定大鼠肺组织中NIX和LC3的表达，并计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值

取新鲜右肺下叶组织150 mg, 加入1 mL的RIPA裂解液后冰上研磨，离心。取上清液，使用BCA试剂盒测定蛋白量。将蛋白样本置于电泳仪中电泳，后经电转、脱脂奶粉溶液封闭，按说明书配制抗体工作液(NIX和LC3抗体均按1∶2 000 稀释),一抗4 ℃摇床孵育过夜，二抗(1∶5 000)室温孵育1 h。条带清洗3次后滴加显色液，放入显色仪中曝光显色。采用Image J图像分析软件测量条带光密度值，并与GADPH或β-actin内参光度值的比值进行相对表达量的计算。

1.10 免疫荧光检测

大鼠肺组织石蜡切片经过梯度乙醇脱蜡，脱水后，吹干，PBS清洗3次，1‰ Triton-X-100与2%羊血清混合室温封闭 1 h。PBS清洗后，加入以下Ⅰ抗[LC3(1∶100)和Tom20(1∶150)],4 ℃孵育过夜。清洗一抗后，加入山羊抗兔荧光二抗(DyLight 594,1∶500)或山羊抗小鼠荧光二抗(DyLight 488, 1∶500)后，室温孵育 30 min。PBS 清洗后，DAPI 复染细胞核。应用共聚焦显微镜(Olympus FV3000)观察LC3与Tom20 在肺组织中的共定位情况。

1.11 统计学处理

采用GraphPad Prism 15软件进行统计分析。测量数值均采用均数±标准差

表示。多组之间比较采用One-Way ANOVA方差分析，SNK-q检验进行各组间差异比较。P<0. 05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组大鼠核心温度变化

建模前，四组大鼠核心温度均在37 ℃左右，差异无统计学意义(P>0.05)。建模过程中Ctrl组和Rapa组的核心温度始终保持在37 ℃左右，而EHS和EHS+Rapa组大鼠核心温度均急剧升高，在入舱80 min时，两组大鼠达到42 ℃以上，较Ctrl组显著升高(P<0.05),提示EHS大鼠模型建立成功。见图1A。

2.2 雷帕霉素对EHS大鼠动脉血中的PaO2、PaCO2以及肺血管通透性的影响

动脉血气分析结果显示，与Ctrl组比较，EHS组动脉血中氧分压(见图1B)和二氧化碳分压(见图1C)均明显下降(P<0.05),而EHS+Rapa组动脉血中氧分压较EHS组显著升高(见图1B,P<0.05),二氧化碳分压也有恢复趋势(见图1C)。伊文氏蓝渗透结果显示，EHS组大鼠肺血管通透性升高；EHS+Rapa组大鼠肺血管通透性较EHS组明显降低(见图1D)。

2.3 雷帕霉素减轻EHS大鼠肺组织的病理学损伤

HE染色结果所示，Ctrl组和Rapa组肺组织结构完整，肺泡轮廓清晰、壁光滑，腔内无液体和(或)细胞渗出(见图2A);EHS组出现肺泡塌陷，肺泡腔出现大量的红细胞、炎症细胞和血浆样物质渗出，病理学评分明显增加(见图2A、2B,P<0.05);与EHS组比较，EHS+Papa组肺泡塌陷减少，炎症浸润程度低，肺泡内未见明显渗出物质，病理学评分较EHS组显著降低(见图2A和、2B,P<0.05)。

2.4 雷帕霉素减轻EHS大鼠肺组织中的细胞凋亡

与Ctrl组比较，EHS组肺组织中的调亡细胞数量增加，凋亡指数升高(P<0.05);EHS+Rapa组肺组织中的凋亡阳性细胞数较EHS组显著减少，凋亡指数降低(P<0.05)。Ctrl组与Rapa组凋亡指数差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图1 各组大鼠核心温度和肺功能的变化

图2 雷帕霉素对EHS大鼠肺组织病理学的影响

2.5 雷帕霉素对EHS大鼠肺Ⅱ型上皮细胞中线粒体形态的影响

透射电镜下观察，Ctrl组和Rapa组肺Ⅱ型上皮细胞中线粒体形态规则，线粒体嵴排列紧密，清晰可见。EHS组肺Ⅱ型上皮细胞中线粒体发生肿胀，线粒体嵴断裂、甚至消失，部分线粒体呈现空泡化改变。EHS+Rapa组肺Ⅱ型上皮中线粒体体积仍增大，线粒体肿胀，但线粒体嵴可见。见图4。

2.6 雷帕霉素对EHS大鼠肺组织中的NIX和LC3表达的影响

免疫印迹结果显示，与Ctrl组比较，EHS组大鼠肺组织中NIX的表达增多，自噬水平标志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高(P<0.05)。EHS+Rapa大鼠肺组织中NIX的表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值较EHS大鼠进一步升高(P<0.05)。Ctrl组和Rapa组之间大鼠NIX表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值差异均无统计学意义(P>0.05)。见图5。

图3 雷帕霉素减少EHS大鼠肺组织凋亡

图4 雷帕霉素对EHS大鼠肺Ⅱ型上皮细胞中线粒体形态的影响(透射电镜，×30 000)  

图5 雷帕霉素对EHS大鼠肺组织中NIX的表达和自噬水平的影响

2.7 雷帕霉素(Rapa)对EHS大鼠肺组织中线粒体自噬水平影响

为进一步探讨Rapa对肺组织中线粒体自噬的影响，本研究对大鼠肺组织进行LC3和Tom20两种蛋白免疫荧光共染，结果显示LC3染色呈绿色荧光，Tom20染色呈红色荧光，两者共定位呈橙色荧光。Ctrl组肺组织中LC3和Tom20的共定位较弱。Rapa组肺组织中LC3和Tom20的共定位稍有增强。与Ctrl组比较，EHS组肺组织中LC3和Tom20的共定位显著增强。EHS+Rapa组肺组织中LC3和Tom20的共定位较EHS组进一步增强。见图6。

图6 Rapa对EHS大鼠肺组织中线粒体自噬的影响

3、讨论

EHS是由高热和剧烈运动等因素作用于机体引起的致死性疾病，其特征性表现为核心温度的急剧升高和多脏器功能障碍[2]。本研究发现，EHS大鼠核心温度快速升高至42 ℃以上，并出现肺组织病理损伤、肺血管通透性和肺组织细胞凋亡增加、肺氧合功能下降，证实EHS大鼠出现ALI。这与既往研究[13]结果一致。

热射病致器官功能损伤机制不完全清楚。线粒体是ROS的主要来源之一，线粒体发生功能障碍诱发细胞内氧化应激增强，ROS表达增加[14]。本研究通过透射电镜发现，热射病大鼠肺Ⅱ型上皮细胞中线粒体发生肿胀、线粒体嵴断裂、部分线粒体出现空泡化，证实热打击造成肺组织细胞内线粒体发生严重损伤。线粒体受损，氧化应激增强，产生ROS反过来又进一步加重线粒体损伤，形成恶性循环，导致“瀑布式”炎症反应，引起细胞发生凋亡、坏死，最终进展为脏器衰竭[15]。所以及时清除受损伤的线粒体对保护器官功能起到一定的积极作用[16]。

越来越多的证据[6]表明，为了维持细胞内线粒体质量控制和稳态，机体通过激活线粒体自噬选择性地清除那些受损或丧失功能的病态线粒体。线粒体自噬的改变与多种疾病有关，如神经退行性变、心力衰竭、癌症以及衰老等[17]。NIX是BCL-2家族中的BH3-only家族成员，是细胞应激下线粒体自噬调控途径之一，并参与线粒体代谢和氧化还原稳态[18]。本研究结果表明，EHS大鼠肺组织中NIX和LC3表达增多，LC3和Tom20相互作用增强，线粒体自噬水平升高。从而证实，EHS引起肺组织中线粒体受损，NIX介导的线粒体自噬被激活。

目前认为，NIX介导的线粒体自噬机制主要包括以下几个方面[19]:通过与Parkin相互作用介导线粒体自噬；NIX作为自噬受体招募At98蛋白家族启动线粒体自噬；NIX增加细胞质中游离的Beclin-l诱导自噬。因此，NIX信号通路可能成为治疗某些疾病的潜在作用靶点。为证实上调NIX通路可以增强线粒体自噬减轻热射病引起的肺损伤，我们选取雷帕霉素作为线粒体自噬的刺激因子，结果发现雷帕霉素改善肺血管通透性和氧合功能，减轻EHS大鼠肺组织病理损伤和细胞凋亡，维持了线粒体正常形态。进一步研究发现，雷帕霉素增加热射病大鼠肺组织中NIX表达，升高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，增强LC3和Tom20相互结合，上调线粒体自噬水平。因此，热打击虽然可以诱导下肺组织NIX介导线粒体自噬的代偿性增加，但不足以清除受损线粒体，维持线粒体动态稳定，而雷帕霉素通过激活NIX介导的线粒体自噬，维持了线粒体正常形态，从而减轻肺损伤。

综上所述，本研究发现EHS可引起肺通透性升高、细胞凋亡增加、线粒体形态受损，最终进展为ALI,而雷帕霉素可通过上调NIX水平，增强线粒体自噬来减轻热射病导致的肺损伤。这为保护热射病器官功能提供了新的理论支持。

参考文献:

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[9]毛汉丁,王娇,王宇曦,等.植入式生物遥测技术在劳力型热射病大鼠实验模型中的应用[J].解放军医学院学报,2021,42(10):1068-1073, 1088.

基金资助:2020年度军队卫生防疫防护专项任务(后卫函[2020]208号); 2023年度军队卫生防疫防护专项任务(后卫函[2023]365号);

文章来源：王佳兴,张玉想,顾焱,等.雷帕霉素上调NIX表达保护劳力性热射病大鼠肺功能[J].中国急救医学,2024,44(06):515-521.