首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 内分泌科论文 > KIT杂合大片段缺失导致斑驳病一家系的临床表型

KIT杂合大片段缺失导致斑驳病一家系的临床表型

2024-07-02 16 上传者：管理员

摘要：目的鉴定一个斑驳病家系的致病基因突变。方法收集斑驳病患者及其家系成员的临床资料，采集外周血，进行全外显子组测序。通过qPCR验证目的基因的缺失；采用gap-PCR结合Sanger测序法确定具体缺失的大小以及位点。结果在先证者4号染色体上存在约1.74 Mb的杂合大片段缺失突变，其中包括了全部KIT(斑驳病的致病基因)。该缺失在家系中呈基因型-表型共分离，在dbSNV数据库中未见该区域的缺失报道。该缺失是目前报道的最小的因KIT全长缺失而导致斑驳病表型的片段缺失。结论 KIT缺失是导致该家系斑驳病表型的原因。

关键词：
KIT
基因缺失
基因诊断
拷贝数变异
斑驳病
加入收藏

斑驳病(piebaldism, MIM:172800)是一种以额部、发际部出现三角形或菱形的白斑和白发为典型临床表现的罕见常染色体显性遗传病。组织病理学研究显示患者皮肤和毛发部位黑色素细胞缺失[1]。患者的临床表现不一，除头面部外，胸腹部、四肢也有可能出现白斑，出生后即可发生且终生存在，周边可出现不同程度的色素沉着[2]。遗传学研究发现，斑驳病的致病基因主要为KIT。KIT位于人类染色体4q12上，可以影响黑素母细胞的增殖分化、迁移等多种活动，75%的斑驳病患者为此基因突变[3]。目前被报道的与斑驳病相关的KIT突变已有100多个，包括点突变、微缺失、微插入以及大片段缺失与插入等多种形式。本文通过全外显子组测序结合实时定量PCR、gap-PCR等方法发现了一个由KIT全基因缺失所导致的斑驳病家系，是目前报道的最小的因KIT全长缺失而导致斑驳病表型的片段缺失。

1、材料与方法

1.1 对象

先证者，女，8岁。在出生后发现额部发际处和双胫前片状白斑，中央有色素性小岛。父母及家族中其他个体无类似表型。

先证者于北京协和医院皮肤科门诊就诊。在获得患者及其家庭成员知情同意并签订知情同意书后，收集患者及其家系成员的临床资料和家族史，进行临床诊断及家系分析(图1A)。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集与DNA的提取：

经中国医学科学院基础医学研究所伦理委员会批准(2022170)。在获得患者及其家系成员的知情同意后，采集该家系3名成员的外周血，采用QIAamp DNA Blood Midi Kit试剂盒(Qiagen公司，51106)提取基因组DNA。

1.2.2 全外显子组的测序：

将提取的患者基因组DNA构建基因组文库，然后通过探针杂交全基因组外显子及相邻内含子区域，并进行富集。富集后的目的基因片段通过二代测序仪PE150(Illumina公司)测序。目标区域平均测序深度138.00×(测序深度高)。测序结束后对原始序列进行生信分析，对样本进行变异检测，包括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)、插入缺失(insertion-deletion, InDel)、拷贝数变异(copy number variation, CNV),并使用ANNOVAR软件注释；采用CoNIFER软件，通过检测样本在一个参考基因组上 reads 的深度分布情况来检测CNV。

1.2.3 实时定量PCR(qPCR)检测患者及对照基因组DNA:

在KIT 1号、5号、21号外显子附近设计3对引物(exon1 F:5′-CCAGCTAGTTGCCTCTTTGG-3′,R:5′-TTGGTGAACAAGGGAAGGAG-3′; Exon5 F:5′-GAGGGACATCAACCTCCAGA-3′,R:5′-CTTG GAACGGACCTCAACAT-3′; Exon21 F:5′-CCCCTCT GCCCACAGAAAATA-3′,R:5′-ATTTGGTGATGGGT GTGGAT-3′),以C2基因为内参基因，家系外健康人为对照，对患者及家系成员的外周血DNA进行实时定量PCR反应来验证缺失。反应体系如下：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)10 μL,DNA 20 ng, 双向引物各10 pmol/L,加双蒸水至20 μL。qPCR反应在QuantStudio 3(Thermo Fisher Scientific, U.S.A)上进行，反应条件为95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s, 40 cycles; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。实时定量 PCR数据采用2-△△Ct法分析，具体方法为：△Ct=目标基因 Ct均值-内参基因 Ct均值，△△Ct=实验组△Ct-对照组△Ct。

1.2.4 Gap-PCR检测断裂点：

在全外显子组测序中提示的缺失片段周围设计引物扩增断裂点周围序列，PCR反应体系如下：25 μL PremixTaq, 4 μL正反向引物混合物(10 pmol/μL),1μL(50 ng)DNA,20 μL双蒸水。反应条件如下：98 ℃ 45 s; 98 ℃ 10 s, 68 ℃ 10 min, 循环35次；68 ℃ 5 min, 4 ℃恒温。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.5 Sanger测序：

将gap-PCR产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行直接测序，结果与健康人类基因组比对，确定断裂点。

1.2.6 生物信息学分析：

参照PubMed、ClinGen、gnomAD、Decipher等数据库，应用在线CNV评级工具ClinGen CNV Pathogenicity Calculator(http: //cnvcalc.clinicalgenome.org/cnvcalc/)、Franklin(https: //frank-lin.genoox.com/),按照美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)与ClinGen联合发布的染色体拷贝数变异解读和报告的技术标准对本研究缺失片段进行致病性分析。

2、结果

2.1 临床表现

先证者，女，8岁，额部近发际处、双胫前皮肤白斑8年，可见片状色素脱失斑(图1B,C,D),中央有色素岛，否认家族史。

2.2 全外显子组测序

测序结果显示KIT、SNAKI2、MC1R等基因编码区及附近出现的变异人群频率均较高，经软件预测其致病性低，未见候选突变。而CoNIFER软件得出的CNV检测结果提示患者4号染色体上有包含KIT的大片段缺失。

2.3 实时定量PCR检测患者及对照基因组DNA

为验证全外显子组测序发现的大片段缺失，对患者及其家属的KIT进行定量分析，发现患者KIT相对拷贝数为家系中健康个体与正常对照基因量的一半，确定患者存在KIT缺失(图2)。

2.4 Gap-PCR与Sanger测序

在全外显子组测序中提示的CNV区域附近设计引物(F:5′-AGGCCTCCCATTTTGGAATATTTTT-3′;R:5′-CGGAGCAACAGTTTTAACAAAACCA-3′)扩增患者、父母及正常对照的DNA并对扩增产物进行凝胶电泳，发现患者扩增出一大约11 000 bp的片段，而父母及正常对照未扩增出相应片段(图3)。将患者扩增产物进行Sanger测序，发现缺失区域为GRCh37/hg19:NC_000004.11:g.54743284_56485321el(图4),长度为1 742 037 bp。

2.5 CNV致病性分析

通过数据库检索，该片段中KIT gnomAD 观测值/预期值(observed/expected, O/E)分数为0.241,gnomAD PLI分数为1.0, DECIPHER HI分数为8.78%,为剂量敏感性基因且有多篇文献报道该基因缺失与患者特异性斑驳病表型相关；其余基因经检索剂量敏感性预测分数均不足。此片段缺失ACMG最终评分为1.45,大于0.99,为KIT的致病性CNV。

图1 斑驳病家系图谱及先证者的皮肤表型

图2 先证者、其父母及健康对照KIT的基因组PCR结果

图3 先证者及父母扩增产物的凝胶电泳图

3、讨论

斑驳病主要的致病基因是KIT,最早由Giebel和Sritz等[4]于1991年报道，此外也有研究者报道SNAI2(SLUG)、MC1R也会导致斑驳病[5,6]。截至2023年4月，HGMD数据库上收录了KIT与斑驳病相关的159种突变，其中包括105种点突变、9种剪切突变、2种调控区突变、小于20 kb的微缺失21种、微插入8种、微插缺5种，大于20 bp的缺失7种，插入1种以及1种复合突变。中国学者已报道了多个与斑驳病相关的KIT突变，通过文献检索与数据库查询，目前已知的中国斑驳病患者KIT突变已有30多种(图5)。

KIT是一种原癌基因，主要编码干细胞生长因子受体(stem cell factor receptor, SCFR),为一种受体酪氨酸激酶。SCFR具有3个功能区：配体结合区、跨膜区域和酪氨酸激酶功能区。当配体与SCFR结合，会在胞外产生同源二聚化的受体，激活细胞内各种转录因子，调控细胞的凋亡、分化、迁移及黑色原生成和黑素小体转移等生命过程[7]。KIT突变后，根据突变类型的不同，会导致SCFR产生不同程度的功能受损。其中，以单倍剂量不足的机制致病的突变主要影响配体结合，临床表型为轻型；而显性负效应的突变如错义突变产生的异常蛋白质影响到了跨膜区或酪氨酸激酶功能区则会导致严重的典型的斑驳病表现[8]。

图4 先证者基因组缺失位置及Sanger测序验证结果

图5 中国斑驳病患者KIT上的已知突变

本研究发现了一例斑驳病家系中患者4号染色体上新发包括KIT的约1.74 Mb的大片段缺失。此缺失突变的出现可能是由于该片段在基因组中重复或相似的片段较多，故而在减数分裂过程中染色体配对分离过程容易出现差错导致染色体片段丢失。该片段缺失可能造成KIT单倍剂量不足，从而影响到黑色素母细胞接收信号，细胞增殖分化及黑色素合成异常，最终产生表型。1991年，有学者发现斑驳病患者有染色体4q11-q12的缺失，其中包括了KIT等基因，是最早的有关KIT全长缺失导致斑驳病的报道[9],随后又发现4q12-q21.1缺失与斑驳病相关[10],以及4q12上2.7 Mb的微缺失会造成斑驳病[11]。而某些病例报道的患者虽有KIT的杂合缺失，但并没有表现出与斑驳病相关的症状[12],这提示KIT缺失导致斑驳病的外显率仍有未知的影响因素。本研究结果发现的缺失片段包括的致病基因与之前的各报道一致。

总之，本研究通过全外显子组测序、实时定量PCR及gap-PCR等方法发现一例斑驳病家系的致病突变为4号染色体上包含KIT全长基因的1.74 Mb缺失。本研究为斑驳病患者的基因诊断和分子遗传学研究提供了新的线索。同时，本研究采用的方法学体系为类似病例的诊断和研究提供了有益的借鉴。未来研究应继续探讨斑驳病的发病机制和治疗方法，提高患者的生活质量。

基金资助:国家重点研发计划(2022YFC2703900); 国家自然科学基金(82394420､82394423); 中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2021-I2M-1-018);

文章来源:张睿,谭妍,马东来,等.KIT杂合大片段缺失导致斑驳病一家系的临床表型[J].基础医学与临床,2024,44(07):954-958.