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通腑理肺汤对脓毒症大鼠肠黏膜免疫屏障保护作用的实验研究

2024-09-10 206 上传者：管理员

摘要：目的:探究通腑理肺汤(Tongfu Lifei Decoction, TLD)对脓毒症大鼠肠黏膜免疫屏障的保护作用及其机制。方法:通过盲肠结扎穿刺术(cecal ligation puncture, CLP)制备大鼠脓毒症模型，随机分为模型组(Model)、通腑理肺汤低剂量组(3.6 g/kg, TLD-L)、通腑理肺汤高剂量组(7.2 g/kg, TLD-H),同时设假手术组(Sham)作为对照，分组给药，1次/日，连续给药7 d。ELISA检测血清IL-1β、TNF-α含量，流式细胞仪检测脾脏细胞Th17、Treg细胞百分比变化，HE染色观察肠组织病理变化，qPCR检测肠组织caspase-3(胱天蛋白酶3)和caspase-9(胱天蛋白酶3)mRNA的表达水平。Western blot检测肠组织caspase-3和caspase-9蛋白表达水平。结果:与Sham组相比，Model组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量、脾脏细胞Th17、Treg细胞数量极显著升高(P<0.01)。与Model组相比，通腑理肺汤组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量、Th17细胞数目极显著降低(P<0.01),Treg细胞数量显著升高(P<0.05)。HE染色结果显示通腑理肺汤可减少炎症细胞浸润，改善肠黏膜损伤。qPCR检测结果显示通腑理肺汤可下调caspase-3、caspase-9 mRNA表达水平。Western blot检测结果显示通腑理肺汤可下调caspase-3、caspase-9蛋白表达水平。结论:通腑理肺汤可保护脓毒症大鼠肠黏膜免疫屏障，其可能是通过维持Th17/Treg平衡、下调IL-1β、TNF-α含量及caspase-3、caspase-9的mRNA和蛋白表达水平发挥肠黏膜免疫屏障保护作用。

关键词：
IL-1β
Th17/Treg
肠黏膜免疫屏障
脓毒症
通腑理肺汤
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脓毒症(sepsis)是由感染引起的全身炎症反应综合征，进一步发展可导致严重脓毒症甚至多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[1]。肠黏膜屏障与脓毒症的发生发展密切相关，有研究发现，肠黏膜屏障损伤是引起MODS的重要因素[2-3]。肠黏膜免疫屏障是肠黏膜屏障的重要组成部分，可维持肠道免疫稳态和保护肠道健康，而Th17/Treg细胞平衡在其中发挥重要作用[4-5]。目前，临床上针对脓毒症的治疗措施以抗生素治疗和免疫疗法为主，但疗效并不显著[6]。因此，探究新的药物及治疗方法对于改善脓毒症肠黏膜免疫屏障损伤具有重要的临床意义。

通腑理肺汤(Tongfu Lifei Decoction, TLD)由国医大师刘尚义所创，可通腑泄下、开宣肺气，经临床证实，能够有效改善脓毒症临床症状，显示出良好的胃肠保护作用[7]。基于此，本研究通过盲肠结扎穿刺术(Cecal ligation puncture, CLP)建立大鼠脓毒症模型，给予通腑理肺汤进行干预，观察血清IL-1β、TNF-α含量、脾脏细胞Th17、Treg细胞数量变化、肠组织病理变化及caspase-3、caspase-9的mRNA和蛋白表达，以初步探讨通腑理肺汤保护脓毒症肠黏膜免疫屏障的作用机制。

1、材料与方法

1.1 实验动物

普通级健康成年SD大鼠24只，雌雄不限，体质量250～300 g, 由上海吉辉实验动物饲养有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0012;于温度24～26 ℃,湿度45%～60%,每日光照12 h的环境中适应性喂养1 周；期间采用标准饲料饲养，自由饮水，实验前禁食6 h。

1.2 实验药物

通腑理肺汤中药材均购于上海源叶生物科技有限公司，组方为大黄20 g, 芒硝、厚朴、连翘、黄芩、杏仁、白及、三七各10 g; 中药材于自来水中浸泡2 h, 经煎煮浓缩、醇沉、调pH值、去醇、过滤及高压消毒后，制备通腑理肺汤药液，生药浓度为1 g/mL,冷藏备用[8]。

1.3 实验试剂和仪器

大鼠白细胞介素1β(IL-1β)ELISA试剂盒2:江苏酶免生物科技有限公司，批号：2020520;大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒：江苏酶免生物科技有限公司，批号：20220506;逆转录试剂：康为世纪，批号：36320;BCA蛋白定量试剂盒：Solarbio, 批号：20220218;caspase-3、caspase-9抗体：Affinity, 批号：36w6138、16g7169。

Micro17R低温高速离心机：Thermo; C6流式细胞仪：BD;CFX Connect实时荧光定量PCR仪：BIO RAD;Eclipse E100正置光学显微镜：Nikon。

1.4 脓毒症模型建立与分组给药

异氟烷气体麻醉大鼠，腹壁正中切口，拉出盲肠，分离肠系膜以释放盲肠；用无菌4号丝线在盲瓣与盲肠中点进行结扎，并用21G无菌针头在结扎部位与盲肠顶端的中点处贯通穿刺盲肠壁，造成穿孔；挤出盲肠内容物，将盲肠推回腹腔，逐层缝合，建立大鼠脓毒症模型[9]。模型建立后随机分为模型组(Model)、通腑理肺汤低剂量组(3.6 g/kg, TLD-L)、通腑理肺汤高剂量组(7.2 g/kg, TLD-H),每组6只大鼠。同时取6 只大鼠设为假手术组(Sham),只做腹壁开口处理，不结扎盲肠，随后缝合腹腔。各给药组大鼠均灌胃给药，1次/日，假手术组和模型组灌胃给予等体积生理盐水，连续7 d。

1.5 ELISA检测血清IL-1β、TNF-α含量检测

大鼠眼眶取血后，3 500 r/min 离心15 min, 取上清液，置于-80 ℃冰箱保存，使用ELISA试剂盒检测血清IL-1β、TNF-α的含量。

1.6 流式细胞仪检测Th17、Treg细胞百分比

取血结束后二氧化碳安乐死各组大鼠，取出脾脏，从中收集淋巴细胞，制成细胞悬液，注入流式管中，上流式细胞仪检测脾脏细胞中Th17、Treg细胞百分比变化情况。

1.7 HE染色观察肠组织病理变化

取病变肠组织，脱水、包埋，切片机上切片，经二甲苯脱蜡水合后，进行HE染色处理，常规脱水、透明、封片。显微镜采集图片，观察肠组织病理变化情况。

1.8 qPCR检测肠组织caspase-3、caspase-9mRNA表达

采用Trizol提取肠组织总RNA,依照逆转录试剂盒配制反应体系，将混合后的液体加入8连管板中置于Realtime PCR仪上进行反应(反应条件：95 ℃,10 min变性；95 ℃,15 s; 60℃,60 s; 40次循环),转录成cDNA,特异性扩增caspase-3和caspase-9。采用2-△△Ct法对数据进行分析，GAPDH为内参。数据以

表示，计算结肠组织中caspase-3和caspase-9 mRNA的表达量。

1.9 Western blot检测肠组织caspase-3、caspase-9蛋白表达

取肠组织样品，用Lysis Buffer提取组织蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳分离，转至PVDF膜，封闭液封闭，加一抗(caspase-3、caspase-9抗体),4 ℃孵育过夜，加相应二抗，室温孵育2 h, 洗膜。ECL化学发光仪显影，以GAPDH为内参，chemi capture 软件拍摄图像并分析。

1.10 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件分析，所有数据以

表示，作图采用GraphPad Prism 6.2软件。多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 通腑理肺汤对脓毒症大鼠血清IL-1β和TNF-α含量的影响

见表1。

表1 各组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量比较

2.2 通腑理肺汤对脓毒症大鼠Th17、Treg细胞百分比变化的影响

见图1。与Sham组比较，Model组大鼠脾细胞Th17、Treg 细胞均显著增加(P<0.01);与Model组比较，TLD-L组和TLD-H组大鼠脾细胞Th17细胞数量极显著降低(P<0.01),Treg 细胞数量显著增加(P<0.05,P<0.01)。

图1 各组大鼠脾脏细胞Th17和Treg 细胞百分比变化情况

2.3 通腑理肺汤对脓毒症大鼠肠组织病理变化的影响

Sham组大鼠肠组织结构基本正常，层次清晰；与Sham组相比，Model组大鼠显示大量炎症细胞浸润，病变侵及浆膜层；与Model组相比，TLD-L组和TLD-H组大鼠肠组织炎症细胞浸润情况较轻，组织结构较为正常，病理损伤较轻。见图2。

图2 各组大鼠肠组织病理学变化(HE,×400)

2.4 通腑理肺汤对脓毒症大鼠结肠组织caspase-3和caspase-9mRNA表达的影响

与Sham组比较，Model组大鼠结肠组织caspase-3和caspase-9 mRNA的表达水平显著升高(P<0.01);与Model组比较，TLD-L组和TLD-H组大鼠结肠组织caspase-3和caspase-9 mRNA的表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01)。见图3。

2.5 通腑理肺汤对脓毒症大鼠结肠组织caspase-3和caspase-9蛋白表达的影响

与Sham组相比，Model组大鼠结肠组织caspase-3、caspase-9蛋白表达水平显著性升高(P<0.01);与Model组相比，TLD-L组和TLD-H组大鼠结肠组织caspase-3、caspase-9蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。见图4。

图3 各组大鼠结肠组织caspase-3和caspase-9 mRNA表达比较

图4 各组大鼠结肠组织caspase-3、caspase-9蛋白表达比较

3、讨论

脓毒症患者肠黏膜免疫屏障功能障碍在中医上属“肠热腑实证”,具有发热、便结、腹满硬痛、口渴欲饮及脘腹胀痛等症状体征，可归于“泄泻”“痞满”“便秘”等范畴[10]。中医学认为“六腑以通为用”“肺与大肠相表里”,故而应以通理攻下为其治疗之根本，同时辅以健脾益气、理气化湿、清热温里[11]。前期研究证实，通腑理肺汤可加速患者胃肠功能恢复，降低MODS发生率，对于治疗胃肠功能障碍疗效显著[7]。方中大黄、芒硝泄下攻积、润肠通便；黄芩、杏仁、连翘清上焦邪热，复肺之宣降；厚朴理气导滞、消痞除满；白及、三七收敛止血、消肿化瘀；全方共奏理气开肺、通腑泄浊、清热解毒之功，切合脓毒症病因病机，恰为对症之方。现代药理学研究表明，大黄可调节免疫系统，活性成分大黄素能够减轻肠道屏障受损，降低促炎细胞因子水平，恢复肠道菌群微生物生态平衡[12];杏仁可改善肠道功能，具有抗炎、增强免疫作用[13];白及活性成分可减轻黏膜炎症、改善局部微循环，促进胃肠黏膜修复[14]。

本研究HE染色结果显示，与Model组相比，给药组肠组织周围炎症细胞浸润明显减少，组织损伤明显改善，提示通腑理肺汤对肠组织病理变化有显著改善作用。临床实验证实，IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子与脓毒症肠黏膜损伤密切相关[15]。Kaminsky等[16]的研究表明，IL-1β可介导免疫细胞的炎症反应，破坏肠上皮连接屏障，加重肠道炎症。TNF-α一方面可激活巨噬细胞引发炎症级联反应，同时产生大量促炎细胞因子以促进炎症；另一方面可刺激肠道微血管内皮细胞和嗜中性粒细胞表面粘附分子的表达，加速中性粒细胞聚集并释放活性氧和蛋白水解酶，从而破坏肠黏膜屏障[17]。本研究结果可见，给予通腑理肺汤干预脓毒症大鼠，IL-1β和TNF-α含量显著降低(P<0.01),表明通腑理肺汤可通过有效调节炎性细胞因子表达抑制炎症反应。

Th17/Treg细胞平衡在维持肠道免疫稳态和调节炎症免疫反应方面具有重要作用，研究证实，Th17/Treg细胞在正常条件下保持平衡，但当此平衡破坏，出现Th17细胞的过度增加和Treg细胞减少时，会导致肠黏膜免疫屏障的损伤[18]。因此，调节Th17/Treg细胞平衡以增强Treg细胞和抑制Th17细胞可能在肠黏膜免疫屏障的保护中具有重要的作用[5]。本研究中，给予通腑理肺汤处理后的脓毒症模型大鼠，Th17细胞数量显著降低(P<0.01),Treg 细胞数量显著增加(P<0.05,P<0.01),提示通腑理肺汤可通过调节Th17/Treg细胞平衡抑制免疫紊乱和肠道炎症，减轻肠黏膜屏障的损伤。

半胱天冬酶(caspase)的关键生物学功能与细胞凋亡有关，研究表明，caspase-3和caspase-9在脓毒症诱导的淋巴细胞凋亡中起重要作用[19]。Marianna Miliaraki等[20]的研究表明，在脓毒症患者中，caspase-3、caspase-9浓度明显升高，可诱导淋巴细胞凋亡，损伤免疫屏障，加重脓毒症患者病情，降低患者的存活率。本研究结果显示，通腑理肺汤组caspase-3、caspase-9 mRNA/蛋白表达水平较模型组显著降低(P<0.01),说明通腑理肺汤可抑制caspase-3、caspase-9 的mRNA和蛋白表达，减少淋巴细胞凋亡，显示出一定的肠黏膜免疫屏障保护作用。

综上所述，通腑理肺汤可保护脓毒症大鼠肠黏膜免疫屏障，其可能是通过维持Th17/Treg平衡、下调IL-1β、TNF-α含量及caspase-3、caspase-9蛋白表达水平来实现的。

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