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大鼠脓毒症肺损伤与中性粒细胞载脂蛋白的相关性研究

2024-12-02 68 上传者：管理员

摘要：目的探究大鼠脓毒症肺损伤与中性粒细胞载脂蛋白(HNL)的相关性。方法 45只大鼠按照随机方法分为对照组、sham组及模型组，模型组建立脓毒症肺损伤大鼠模型，sham组开腹后仅游离盲肠后关腹，不进行结扎和穿刺，对照组为健康大鼠。使用试剂盒检测各组大鼠血清白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及HNL;血气分析仪检测氧合指数；计算肺组织湿/干比；HE染色观察肺组织病理形态，计算肺损伤评分。结果对照组及sham组12、24、36 h的IL-6、IL-1β、TNF-α、HNL水平、氧合指数、肺组织湿/干比、肺损伤评分比较，差异均无统计学意义(均P>0.05);与sham组相比，模型组12、24、36 h的IL-6、IL-1β、TNF-α、HNL水平、氧合指数、肺组织湿/干比、肺损伤评分均升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。对照组大鼠12、24、36 h肺组织结构正常，且未见水肿，sham组大鼠12、24、36 h肺组织仅有少量炎症细胞，模型组大鼠12、24、36 h肺组织结构严重破坏，肺泡萎陷，炎症细胞严重浸润，但随着时间延长病理改善。脓毒症肺损伤大鼠中，HNL与IL-6、IL-1β、TNF-α、肺部湿/干比、肺损伤评分呈现正相关性(均P<0.05),与氧合指数呈现负相关性(P<0.05)。结论脓毒症肺损伤大鼠中HNL显著升高，炎症反应严重，肺组织湿/干比、肺损伤加重，氧合指数降低，且HNL水平与IL-6、IL-1β、TNF-α水平、肺组织湿/干比、肺损伤呈正相关性，与氧合指数呈负相关性。

关键词：
中性粒细胞载脂蛋白
动物试验
大鼠
氧合指数
炎症因子
病理形态
肺损伤
脓毒症
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脓毒症是重症患者死亡的首要原因，据最新全球疾病负担统计数据显示：每年新发约5 000万例脓毒症患者，其病死率高达20%～40%,严重威胁患者生命安全[1]。脓毒症的发病基础是宿主免疫抗感染作用减弱，随着疾病进展可发生多系统炎症反应和多器官功能衰竭，甚至导致患者死亡[2]。临床上，肺部是脓毒症累及的器官之一，炎症和氧化应激在脓毒症所致的肺损伤中起关键作用，抑制过度产生的炎性反应及应激反应可显著改善肺功能和生存状态[3]。中性粒细胞载脂蛋白(human neutrophil lipocalin, HNL)是中性粒细胞的主要成分，HNL含量的高低与炎症反应过程中的中性粒细胞数量相关，当发生急性细菌感染时，血液中HNL浓度可在1～2 h内明显升高并加重病情[4]。研究[5]表明，HNL水平上升可导致肺部炎症加重，可作为一种细菌感染标志物。脓毒症患者血清中HNL水平显著升高，且预后不良患者血清HNL水平较预后良好患者显著升高，因此，检测血清HNL水平可较好反映脓毒症患者预后情况[6];但HNL与脓毒症肺损伤的关系还有待考量，故本研究通过建立脓毒症肺损伤动物模型，探究HNL与该疾病发生发展的关系。

1、材料与方法

1.1试验动物

无特定病原体(specific pathogen free, SPF)等级(Sprague Dawley)成年45只雄性大鼠，体重(230±20)g,鼠龄3～4周，购自南京卡文斯生物技术有限公司，动物许可证号：SYXK(宁)2022-0007。在温度23～25℃,湿度50%～60%环境下自由进食及饮水。符合动物伦理委员会审批。

1.2主要试剂与仪器

戊巴比妥钠(上海新亚药业有限公司，国药准字H31021725);磷酸盐缓冲液、0.25%胰酶(HyClone公司，货号：SH30256.01、SH30042.01);苏木精-伊红试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：G1120);白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(Abcam公司，货号：ab9722、ab208113、ab286149);HNL试剂盒(上海梵态生物科技有限公司，货号：FT-PC20691);GAPDH兔多克隆抗体(赛默飞世尔科技有限公司；货号：PA1-16777);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(碧云天生物科技有限公司，货号A0208);HBS-1096A酶标仪(上海研卉生物科技有限公司);TDZ4-WS低速台式离心机(湖南湘瑞生物科技有限公司);IX71型倒置拍照显微镜(上海赖氏电子科技有限公司);DYCP-31E电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.3分组、脓毒症肺损伤动物建模

45只大鼠按照随机数字方法分为对照组、sham组及模型组，均15只。模型组依据文献[7]建立脓毒症肺损伤模型。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，仰卧位固定后将其腹部毛发脱去并消毒，腹中切口约2 cm,进行盲肠尾部和回盲瓣中间结扎和穿刺，并对其进行轻微按压，将肠腔内物挤至腹腔位置后进行伤口缝合处理。sham组开腹后仅游离盲肠后关腹，不进行结扎和穿刺。造模后大鼠出现竖毛、腹胀和腹腔积液现象，皮毛杂乱无光泽，眼角出现血性分泌物等表现，则表明造模成功。模型组大鼠均建模成功。建模成功后36 h时模型组感染死亡3只，剩余12只。

1.4血清炎症因子水平及HNL水平检测

建模成功后的12、24、36 h,抽取尾部静脉血2 mL,分两次收取。静脉血放入试管，置入离心机以3 000 r/min离心15 min,取血清于-20℃冰箱保存后均严格按照ELISA试剂盒说明书相关规范进行，ELISA法检测大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、HNL含量。

1.5氧合指数

建模成功后12、24、36 h,抽取胸主动脉血3 mL,立即采取血气分析，观察动脉血氧分压(partial pressure of arterial blood oxygen, PaO2)值，依据吸入气中的氧浓度分数(fraction of inspirationO2, FiO2)计算氧合指数(PaO2/FiO2)。

1.6肺组织湿/干比

建模成功后12、24、36 h,处死大鼠取右肺组织，采用电子天平称湿重，后放入80℃电热干燥箱中烤18 h,称干重，计算湿/干比，肺组织湿/干比=(湿重-干重)/干重×100%。

1.7 HE染色及病理评分

建模成功后12、24、36 h,取肺组织甲醛固定24 h后，常规脱水，石蜡包埋后，采用5μm厚度切片。将切片置于二甲苯中脱蜡，乙醇脱水(70%→80%→90%→95%),自来水冲洗后，苏木精染色，1%的盐酸-乙醇分化，水洗蓝化，1%的伊红复染，乙醇透水，二甲苯透明及中性树脂封片，显微镜观察病理形态。参照NishinaK的评分标准。0分：最轻微损伤；1分：轻微损伤；2分：中度损伤；3分：重度损伤；4分：最严重损伤。总分作为肺组织的病理评分。

1.8统计学方法

应用SPSS 26.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差

表示，多组间比较采用单因素方差分析；两组间对比采用配对样本LSD-t检验；不同时间计量资料比较采用重复测量方差分析；采用Pearson分析相关性；以P≤0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1各组大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较

组间比较：对照组及sham组的12、24、36 h的IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较，差异无统计学意义(均P>0.05);与对照组及sham组相比，模型组12、24、36 h的IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高，差异均有统计学意义(F值分别为41.720、116.300、25.480,均P<0.05)。时间比较：模型组随着时间的延长，IL-6、IL-1β、TNF-α水平逐渐降低，差异均有统计学意义(F值分别为3.576、16.100、4.877,均P<0.05)。见表1。

表1各组大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较

2.2各组大鼠HNL水平比较

对照组及sham组的12、24、36 h的HNL水平比较，差异无统计学意义(均P>0.05);与对照组及sham组比较，模型组12、24、36 h的HNL水平升高(均P<0.001);模型组组内比较，与12 h相比，24、36 h的HNL水平降低(均P<0.05),但24 h与36 h比较，差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

2.3各组大鼠肺部湿/干比比较

对照组及sham组的12、24、36 h的肺部湿/干比比较，差异无统计学意义(均P>0.05);与对照组及sham组相比，模型组12、24、36 h的肺部湿/干比均升高(均P<0.05);模型组组内比较，与12 h相比，24、36 h的肺部湿/干比降低(均P<0.05),但24 h与36 h比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2各组大鼠HNL水平比较

表3各组大鼠肺部湿/干比比较

2.4各组大鼠氧合指数比较

对照组及sham组的12、24、36 h的氧合指数比较，差异无统计学意义(P>0.05);与对照组及sham组比较，模型组12、24、36 h的氧合指数均降低(均P<0.05);模型组组内比较，与12 h相比，24、36 h的氧合指数均升高(均P<0.05),但24 h与36 h比较差异无统计学意义(P>0.05),见表4。

表4各组大鼠氧合指数比较

2.5各组大鼠肺组织病理形态及肺组织损伤评分比较

对照组及sham组的肺组织损伤评分均为0分。模型组12、24、36 h的肺组织损伤评分分别为(2.82±0.37)、(2.24±0.30)、(1.89±0.27)分，模拟组与对照组、sham组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。与12 h比较，24 h肺组织损伤评分降低(P<0.05),与24 h比较，36 h的肺组织损伤评分降低(P<0.05)。HE染色显示：对照组大鼠12、24、36 h肺组织结构正常，且未见水肿，sham组大鼠12、24、36 h肺组织仅有少量炎症细胞，模型组大鼠12、24、36 h肺组织结构严重破坏，肺泡萎陷，炎症细胞严重浸润，但随着时间的延长病理改善，见图1。

2.6脓毒症肺损伤大鼠HNL与IL-6、IL-1β、TNF-α、肺部湿/干比、氧合指数、肺损伤评分相关性分析

脓毒症肺损伤大鼠中，HNL与IL-6、IL-1β、TNF-α、肺部湿/干比、肺损伤评分呈现正相关性(均P<0.05),与氧合指数呈现负相关性(P<0.05),见表5。

图1各组大鼠肺组织病理形态比较(200×)

表5脓毒症肺损伤大鼠HNL与IL-6、IL-1β、TNF-α、肺部湿/干比、氧合指数、肺损伤评分相关性分析

3、讨论

脓毒症引起的肺损伤是一种常见的并发症，严重影响患者预后[8]。中性粒细胞是循环中最丰富的免疫细胞，在宿主防御细菌感染中起着至关重要的作用。然而，在脓毒症期间，过度的中性粒细胞激活，浸润肺部可加剧肺损伤。HNL是一种主要由活化的中性粒细胞释放的小分泌蛋白，参与炎症反应，包括脓毒症[9]。在本研究中，旨在探讨HNL与脓毒症诱导的大鼠肺损伤的相关性，有助于深入了解其潜在机制，并有可能为治疗疾病找到新的治疗靶点。

本研究结果显示，脓毒症肺损伤大鼠中IL-6、IL-1β、TNF-α显著升高，在12 h表达最高，24 h及36 h时逐渐降低。在脓毒症诱发的多器官损伤中，肺部是最受累的器官，肺部是巨噬细胞较集中的器官，而巨噬细胞是炎症细胞因子的主要来源之一，检测炎症因子可较好反映肺组织炎症反应程度[10]。研究[11]表明，IL-6是一种多功能细胞因子，能够促进炎症反应的发生，并参与免疫细胞的活化和增殖，在脓毒症肺损伤中，IL-6的浓度明显升高，与肺损伤的程度呈正相关。脓毒症患者的IL-1β水平也明显升高，IL-1β通过激活炎性细胞和表达细胞黏附分子，进一步加快肺组织破坏[12]。TNF-α是炎症反应中最具代表性的细胞因子之一，能够诱导其他炎症介质的产生，并参与炎症细胞的活化和迁移[13]。本研究认为在脓毒症肺损伤中IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高与机体促炎因子及抗炎因子失衡，使肺损伤加重相关。IL-6、IL-1β和TNF-α在脓毒症肺损伤中12 h时达到最高水平，后逐渐降低，可能与随着疾病进展机体免疫细胞会对这些炎症介质进行主动清除，以恢复免疫平衡和减轻炎症反应，进而降低上述炎症因子水平有关。

本研究发现，脓毒症肺损伤大鼠中HNL水平升高、肺部湿/干比、肺损伤增加的同时氧合指数有所降低，说明在脓毒症肺损伤疾病发展过程中HNL水平升高，肺损伤加重，并可影响呼吸功能。HNL是人体重要的载体蛋白超家族成员，常规状态下表达极低，而当机体受到感染后迅速升高，升高时间优于C反应蛋白等常规炎症指标，并在感染控制后表达下降[14-15]。研究[16]表明，在肺源性脓毒症患者中HNL水平显著升高，中性粒细胞的活化可加重肺上皮细胞损伤，同时疾病发展过程中细菌体裂解产物可提高巨噬细胞活性，也升高HNL的表达。另有研究[17-18]表明，在慢性阻塞性肺疾病患者中HNL表达升高，认为是疾病发展过程中机体中性粒细胞激活，进而加快HNL进一步释放，并加重疾病进展。本研究认为脓毒症肺损伤大鼠在12 h时，HNL表达最高，而在24 h和36 h时逐渐降低，可能在疾病早期引起了中性粒细胞的活化，导致HNL的表达升高，随着时间的推移，炎症反应可能逐渐减弱，导致HNL的水平下降。脓毒症发生发展过程中导致炎症介质的释放，如细胞因子、趋化因子等，这些炎症介质可以引起肺血管通透性增加和肺泡水肿，从而导致肺部湿/干比升高[19]。同时，脓毒症发生时导致细菌或病毒产生的毒素释放进入血液，血管扩张血压下降，继而出现肺组织缺血缺氧，损伤肺功能，导致氧合指数下降[20]。本研究结果显示：Pearson相关性分析发现，脓毒症肺损伤大鼠中，HNL与IL-6、IL-1β、TNF-α、肺部湿/干比、肺损伤评分呈现正相关性，与氧合指数呈现负相关性，说明HNL可参与脓毒症肺损伤大鼠炎症反应、肺损伤及呼吸功能。本研究认为HNL是中性粒细胞活化的标志物，而IL-6、IL-1β和TNF-α是炎症介质，HNL激活可引起炎症反应，升高IL-6、IL-1β和TNF-α水平进一步导致肺部湿/干比上升，肺损伤加重。另外，脓毒症肺损伤中HNL升高会导致肺泡通气和血液灌注不匹配，中性粒细胞的活化可能还会导致血管内皮功能障碍和微血栓形成，进一步加重氧合指数的下降。

综上所述，脓毒症肺损伤大鼠中HNL显著升高，炎症反应严重且肺组织湿/干比升高、肺损伤加重，氧合指数降低。且HNL水平与IL-6、IL-1β、TNF-α水平、肺组织湿/干比、肺损伤呈正相关性，与氧合指数呈负相关性。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

参考文献:

[3]阮本良,邵敏,韩晓洁.脓毒症继发急性肺损伤患者血清CCL25和PARK7表达水平及其临床价值研究[J].现代检验医学杂志,2024,39(1):90-94,117.

[4]陈翠竹,马寅舰.血清HNL､ANC对腹腔细菌感染的鉴别价值研究[J].中外医学研究,2023,21(29):64-67.

[5]李丹,郑裕鹏,邱玉杏,等.HNL､ANXA1 mRNA表达水平与COPD合并肺部感染病原菌分布及药物敏感性的关系[J].热带医学杂志,2019,19(10):1233-1236.

[7]黄立搜,楼黎明,王世强,等.脓毒症大鼠急性肺损伤机制研究[J].浙江中西医结合杂志,2015,25(10):918-920.

基金资助:国家自然科学基金项目(81960342);新疆医科大学创新训练计划项目(S202210760160);

文章来源:郑军,祝木建,李江东,等.大鼠脓毒症肺损伤与中性粒细胞载脂蛋白的相关性研究[J].中国感染控制杂志,2024,23(11):1344-1349.