脓毒症多是严重创伤后感染而导致的全身综合性炎症反应，也是感染宿主由于反应失衡而引发的机体多器官功能障碍，是一直以来临床内外科重症与危重症在治疗时较常见的疾病之一[1]。而疾病的进一步恶化还可导致器官功能障碍、脓毒性休克甚至衰竭、死亡[2]。脓毒症的疾病进程较为迅速且预后较差，临床治疗主要以控制感染与器官维持进行干预，早发现、早干预、早治疗不仅能够降低疾病引起的不良反应，也有利于改善患者预后[3]。现阶段，脓毒症患者早期所产生的全身免疫炎症反应可导致大量的炎性细胞因子不断聚集/堆积，进而使得组织器官遭到破坏发生损伤，且随着疾病进程的不断延长以及病情的不断加重，还会伴随产生一系列代偿性抗炎症反应，继而导致免疫功能麻痹、继发性感染等连锁反应发生[4]。调节性T细胞为一类负向免疫调节细胞，可通过不同途径参与调控人体免疫进程。而滤泡调节性T细胞(follicular regulatory T cells, Tfr)作为抑制B细胞免疫反应的关键因子，不仅能够经由分泌免疫抑制分子或直接同细胞进行接触，使抑制B细胞分化成为浆细胞阻滞抗体形成，而且还能降低器官移植后抗体介导的排斥反应[5]。Tfr细胞其表达异常也可能与脓毒症的发展进程具有重要联系，但是，目前关于脓毒症发病时期Tfr细胞与细胞免疫因子T淋巴细胞亚群的相关研究尚不全面，且相关报道较少。因此，本文通过探究脓毒症时期炎性因子与Tfr细胞对疾病的影响以及对患者预后的干预，进而为临床脓毒症的诊治提供一定的基础研究依据。

1、资料与方法

1.1资料

选取2020年6月—2022年6月在本院进行脓毒症住院治疗的100例患者作为本次研究对象，将其列为脓毒症组，另取同期本院健康体检者100例作为健康对照组。脓毒症组男性52例，女性48例；年龄为20岁～52岁；疾病原因：肺部感染37例，肠道感染19例，皮肤软组织感染11例，其他原因引起33例。健康对照组男性49例，女性51例；年龄为19岁～50岁。经比较2组患者在性别、年龄等基本资料的比较中差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本次研究经本院伦理委员审核批准同意(编号：LSH2020LS0508)。纳入标准：(1)均符合脓毒症诊断标准[6]的初诊患者，即存在感染或疑似感染的；(2)感染和序贯器官衰竭评分(sequential organ failure assessment, SOFA)标准升高≥2分；(3)均对本次研究知情和同意的。排除标准：(1)超过/未达到20周～52周岁年龄区间的；(2)临床资料不完全者；(3)伴随恶性肿瘤、心脑血管疾病以及传染病的；(4)处于孕期或哺乳期的妇女；(5)肝功能障碍(肝功能Child-Pugh分级≥10分);(6)肾功能不全(血肌酐≥186μmol/L,肾小球滤过率<60 ml/min,慢性肾脏病≥3级);(7)具有自身免疫性疾病；(8)由于个人原因中途退出此次研究的患者。

1.2方法

1.2.1检测方法

患者空腹12 h,次日清晨抽取静脉血3 ml,肝素抗凝，于室温下3 000 r/min离心15 min,将上层血清进行分离，采用ELISA法分别检测患者血清中促炎性细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)以及抑炎细胞因子(IL-4、IL-10、IL-35)的水平，其中IL-6、IL-1β、IL-10检测试剂盒均购自美国RD公司，IL-4、IL-35检测试剂盒购自中国武汉博士德生物科技有限公司，本次检测均严格按照说明书进行操作实施。

1.2.2细胞收集

收集各组患者的外周血各5 ml,采用RPMI1640基础培养基将其1:1进行稀释完成后，将其融入进等体积的人淋巴细胞分离液中，并以800×g离心15 min,将中层淋巴细胞小心缓慢的吸取，将其置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，以进行后续实验。

1.2.3流式细胞仪检测滤泡调节性T细胞(follicular regulatory T cell, Tfr)标志物CD3+、CD4+、CD4+CD25+

将每组细胞量为5×105的细胞分别使用相对应的免疫抑制剂刺激48 h后，磁珠分选出Tfh细胞，并在含有10%胎牛血清的培养基中培养48 h,并收集孔中淋巴细胞，选取抗凝全血25μl加入试管，添加CD25-FITC 5μl、CD4-藻红蛋白5μl、CD3-藻红蛋白5μl充分混匀后于常温下避光反应15 min,在添加溶血剂500μl后，于37℃的水浴箱内静置15 min,通过流式细胞仪对Tfr细胞标志物CD3+、CD4+、CD4+CD25+等进行检测。

1.2.4脓毒症预后划分

依据王玉华等的研究[7]及脓毒症患者预后情况分为预后良好组和预后不良组。预后良好标准：患者在观察1个月后，其组织灌注、炎症和器官功能等有明显转变或恢复至正常状况；而预后不良标准为组织灌注、炎症和器官功能等指标均未有好转或者患者在观察期间产生死亡现象。

1.3统计学处理

采用SPSS 25.0软件对数据进行录入进行数据分析，计量资料作Kolmogorov-Smimov正态性检验，如正态分布结果以(x¯±s)表示，两样本均数比较采用t检验.以单因素分析有意义的因素为自变量，以脓毒症预后因素为因变量，进行多因素logistics逐步回归分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 2组患者血清中促炎细胞因子表达比较(IL-6、IL-1β、TNF-α)

与健康组比较，脓毒症组患者血清中促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α等指标均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 2组患者血清中促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α比较(x¯±s,pg/ml)

2.2 2组患者血清中抑炎细胞因子表达比较(IL-4、IL-10、IL-35)

与健康组比较，脓毒症组患者血清中抑炎细胞因子IL-4、IL-10、IL-35等指标均显著降低，差异有统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 2组患者血清中抑炎细胞因子IL-4、IL-10、IL-35比较(x¯±s,pg/ml)

2.3 2组患者Tfr细胞标志物CD3+、CD4+、CD4+CD25+比较

与健康组比较，脓毒症组患者的Tfr细胞标志物CD3+、CD4+、CD4+CD25+等指标均显著升高，差异有统计学意义(P>0.05)(表3)。

2.4预后良好与预后不良脓毒症患者的相关分析

在脓毒患者的预后分析中发现，与预后良好的脓毒症患者相比较，预后不良的脓毒症患者的抑炎细胞因子(IL-4、IL-10、IL-35)显著降低，促炎细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)及Tfr细胞标志物(CD3+、CD4+、CD4+CD25+)显著升高，差异有统计学意义(P<0.05,表4)。

表3 2组患者Tfr细胞标志物CD3+、CD4+、CD4+CD25+比较(x¯±s)

表4影响脓毒症患者预后的指标分析(x¯±s)

2.5脓毒症预后影响因素分析

采用多因素logistic回归分析中，以脓毒症预后不良为因变量，在以IL-4、IL-10、IL-35、IL-6、IL-1β、TNF-α、CD3+、CD4+、CD4+CD25+为自变量的分析结果中表明，IL-4、IL-10、IL-35、IL-6、IL-1β、TNF-α、CD3+、CD4+、CD4+CD25+等均是导致脓毒症患者预后不良发生的关键因素(表5)。

表5脓毒症预后logistics回归分析

3、讨论

脓毒症在临床上病死率较高，不仅可对患者生命健康造成威胁也会给家庭和社会带来沉重负担[8,9]。有学者认为，该病的产生可引发机体细胞代谢紊乱、组织缺血、缺氧及多器官功能障碍[10]。疾病早期，临床症状并不显著，且由于缺乏特异性较强的敏感性指标对其进行判断，因此，往往在中晚期时被确诊，此时不仅治疗难度大，也进一步增加了患者的痛苦及经济压力。据统计，在全球范围内约1 000人中至少有3个人患有脓毒症，总病死率高达20%[11]。因此，及时找寻脓毒症早期诊断的相关标记对临床治疗具有重要意义。

脓毒症的产生是血流感染的结果，疾病期由于病原微生物入侵血液，随着血流循环游走于全身，经繁殖致身体多器官遭到毒性侵袭、感染，发生严重毒性反应[12]。在脓毒症初期，由于大量毒素堆积和有毒物质的连续性诱导，导致机体分泌炎症介质总量增加，使体内免疫应答反应增强[13,14]。随着疾病不断发展，患者将不断出现免疫失衡、特异性功能紊乱等现象，从而加重肾脏负担，导致有毒物质无法正常向体外排出，使毒素清除率大大降低甚至过量增加，最终加重病情。因此，治疗时应以控制和清除体内杂质、增强免疫，改善患者预后为主要方向[15]。目前认为，脓毒症发病机制可能与机体免疫细胞功能被破坏相关，当机体产生免疫紊乱时，会使大量淋巴细胞凋亡和免疫被抑制，并通过释放大量促炎介质加重病情。同时，随着疾病进程的不断深入，机体内的T淋巴细胞也会产生不同程度的变化，其中T细胞亚群为T细胞里较为关键的表面抗原标志物，能够通过将靶细胞直接杀伤进而参与到免疫调节中来。Tfr细胞为B细胞免疫的关键调节因子，不仅能够与免疫抑制因子一同间接的抑制B细胞的增殖和分化，还能够通过调节细胞表面的细胞毒T淋巴细胞的相关抗原分子直接发挥调节功能，其中CD4+细胞属于辅助/诱导T淋巴细胞，CD3+是全血T淋巴细胞，能够在细胞免疫效应时期及变态反应阶段构成大量淋巴因子，从而参与机体中炎症反应循环，并加速抑制抗原物质的不断形成。调节性T细胞CD4+CD25+为一类负向调控的免疫细胞因子，主要发挥免疫抑制效应、干预机体自然免疫以及获得免疫效能等作用[16,17]。文中研究结果显示，脓毒症时期患者体内的Tfr细胞标志物CD3+、CD4+、CD4+CD25+等均显著高于健康人群，提示脓毒症患者发生细胞免疫低下可能与Treg细胞CD3+、CD4+、CD4+CD25+的升高具有一定相关性。分析其影响机制可能是Treg细胞能够通过增加IL-10等抗炎细胞因子来抑制淋巴细胞增殖，通过半胱天冬酶级联反应使得T淋巴细胞彼此杀伤或直接自杀，而活化和增殖的T细胞数量下降，进而从免疫亢进转向免疫抑制。且有学者在研究中也发现，临床中CD4+CD25+在脓毒症患者的免疫调节机制中能够发挥极其重要的细胞免疫抑制效应，即处于脓毒症时期的患者CD4+CD25+水平不断上升，可一定程度上加重机体的免疫无反应现象[18]。

脓毒症时期，由于患者体内的炎症因子大量堆积导致抑炎因子逐渐被抑制，进而促进了疾病的不良反应形成，极大的影响着患者的治疗和预后。文中研究显示，脓毒症患者的促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α会随着疾病的不断加重而成不断上升的变化趋势，可见在脓毒症发生阶段，基础性的疾病反应多以分泌大量炎性介质为其主要变化特点，同时也证明了这些细胞因子在加重疾病过程中具有极其重要的预警作用。这一时期，持续性升高的IL-6、IL-1β、TNF-α因子提示了患者的病情已面临危险状态并可能导致不良反应产生。本文研究显示，脓毒症患者血清中的IL-4、IL-10、IL-35等抑炎细胞因子明显降低，提示炎症因子的异常表达对患者脓毒症时期的疾病反应具有重要影响。抑炎因子和促炎因子的不断消长也一定程度上决定了疾病的发展与转归进程，且在两者的不断斗争过程中，若是促炎因子逐渐产生回落而抗炎因子逐渐升高，那么两者便达到了动态平衡效果，那么脓毒症的部分症状可能会在一定程度上得到缓解。但如果促炎因子处于持续性升高状态，而抑炎因子与之相反且并不能对其进行有效抑制，那么此时便会致使炎症反应不断发生扩增，最终导致患者病情恶化甚至发生死亡[19]。同时，在疾病进程中，若促炎因子一直处于持续性升高且两者均不能保持动态平衡的前提下，不仅可导致机体处于一种免疫紊乱的状态之中，还能够极大程度的引发病情恶化。脓毒症患者炎症反应加剧，分泌大量IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子并处于免疫激活状态下，而随着病程的延长IL-4、IL-10、IL-35等抗炎因子分泌降低，免疫功能降低。文中在采用多因素logistic回归的分析中发现，炎症因子与Tfr细胞的失衡均是导致脓毒症患者预后不良的影响因素。且有大量研究发现，在脓毒症中炎症因子的异常表达对疾病进程以及患者的预后具有极其重要影响[20]。另在有关动物实验的研究中发现，脓毒性发病初期，促炎因子与抑炎因子均会出现不同程度的异常现象，且随着越来越多不良反应的发生，使得促炎因子的活化程度变得更加迅速[21]。可见，动态检测患者机体炎症因子浓度不仅能够判断患者病情的阶段状态以及恶化程度，同时还可用于判断患者预后。因此，在拮抗促炎因子过度分泌的同时提高机体免疫功能，改善免疫抑制状态，以达到促炎因子与抗炎因子的平衡才是脓毒症治疗和实现良好预后的有效方法。 且已有相关研究表明，对患者有恶性肿瘤疾病的人群，通过稳定体内Tfr细胞的平衡不仅可显著降低体内炎性水平还能够抑制肿瘤细胞的恶性增殖[22]。对于脓毒症患者而言，检测Tfr细胞水平不仅可能作为评估脓毒症患者病情严重程度及预后的敏感指标，还可能为临床治疗提供有效靶点。

综上所述，以炎症因子及Tfr细胞为主的检测对于指导临床脓毒症疾病的治疗具有重要意义，并有望成为相关感染性疾病治疗的关键靶点。

参考文献:

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基金资助:浙江卫生科技计划(2020KY1070);浙江省基础公益性项目(LGC22H100002);

文章来源:朱红俊,陈佳琦.Tfr细胞及炎性因子对脓毒症患者的影响[J].中国卫生检验杂志,2023,33(16):1963-1967.