首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 脓毒症论文 > 甘青青兰多糖对脂多糖诱导小鼠脓毒症心肌损伤保护作用

甘青青兰多糖对脂多糖诱导小鼠脓毒症心肌损伤保护作用

2024-06-20 94 上传者：管理员

摘要：目的研究甘青青兰多糖保护脂多糖诱导小鼠脓毒症心肌损伤的作用机制。方法建立H9c2心肌细胞炎症模型，采用RT-qPCR评价甘青青兰多糖对NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-10的mRNA表达的影响。采用脂多糖建立小鼠脓毒症心肌损伤模型，通过小动物超声成像系统评价小鼠心脏的功能；ELSIA法检测小鼠血清中炎症因子的水平；用试剂盒检测血清中心肌酶的水平。结果甘青青兰多糖可通过调节小鼠心肌组织及血液中NLRP3、IL-1β、TNF-α、IL-10以及心肌酶的表达来改善小鼠的心脏功能。结论甘青青兰多糖对脂多糖诱导小鼠脓毒症心肌损伤具有保护作用，其机制可能是通过抑制NLRP3小体活化，进而抑制炎症因子的释放，改善心肌组织的炎症水平。

关键词：
NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3
多糖
心肌损伤
心肌细胞
心肌酶
甘青青兰
脓毒症
加入收藏

脓毒症是由创伤、休克、感染等引起的宿主全身炎症反应的综合症，会引起宿主的器官出现功能障碍，而心脏是最易受损的靶器官之一[1]。脓毒症导致的心肌炎症可能是心脏功能障碍的主要原因之一[2]。甘青青兰Dracocephalum tanguticum Maxim.为青藏高原地区特有的药用植物，《中华人民共和国卫生部药品标准藏药》第一册中载有200个含有甘青青兰的藏药制剂。甘青青兰主要用于治疗胃炎、肝炎、愈疮和关节炎等疾病[3],但其对脓毒症导致的心肌炎症是否具有保护作用未见报道。现通过腹腔注射脂多糖构建小鼠脓毒症心肌炎症模型，探究甘青青兰多糖对小鼠心肌炎症的保护作用及对NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3信号通路的影响，为该药材药用价值的开发提供实验依据。

1、实验部分

1.1仪器、试药与动物

Vevo3100LT超高频小动物超声成像系统(日本富士)。Invitrogen TRIzoL(康为世纪生物科技有限公司);二甲基亚砜(DMSO,美国Thermo Scientific);DMEM高糖完全培养基、胎牛血清、青霉素链霉素双联抗生素、0.25%胰蛋白酶(美国Gibco);TUNEL染液(亚科因生物技术有限公司);鼠源白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-10、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、β-actin引物(上海生工生物技术有限公司);RNA逆转录试剂盒、SYBR Green Mix(翌圣生物科技上海股份有限公司);乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷草转氨酶(AST)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)试剂盒(南京建成生物工程研究所);甘青青兰(西藏藏医药大学，经鉴定为甘青青兰Dracocephalum tanguticum Maxim.);H9c2心肌细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)。 ♂C57BL/6J小鼠(江苏集萃药康生物科技股份有限公司，生产许可证：SCXK苏2018-0008),6～8周龄，体重20～25 g。

1.2方法与结果

1.2.1对H9c2心肌细胞活力的影响

取H9c2心肌细胞，用含10%血清和1%双抗的DMEM高糖培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养，当细胞长满培养瓶底部85%～90%时进行细胞传代。将处于对数生长期的H9c2心肌细胞以每孔6×103的密度接种于96孔板中，贴壁12 h后，加入0.05～1 mg·mL-1甘青青兰多糖(DTP),同时设不加药物的对照组和不加细胞及药物的空白组。分别在干预12、24、48 h后，加入噻唑蓝(MTT)试剂，于37℃孵育4 h后，每孔加入100μL DMSO,于37℃继续孵育4 h,在570 nm处检测OD值，计算细胞活力。细胞存活率=(OD给药- OD空白)/(OD对照-OD空白)×100%。由图1可知：在给药12、24、48 h后，0.05～0.2 mg·mL-1甘青青兰多糖对H9c2心肌细胞的活力无显著影响，说明此浓度范围内并未表现出毒性作用。故选择0.05、0.1 mg·mL-1甘青青兰多糖进行后续细胞实验。同时，考虑到更换细胞培养液的频率及甘青青兰多糖在动物水平的给药频率(每天1次),故在细胞水平选择药物作用时长为24 h。

图1甘青青兰多糖作用12 h(A)、24 h(B)、48 h(C)后对H9c2心肌细胞活力的影响

1.2.2对脂多糖诱导H9c2心肌细胞中炎症因子表达的影响

取对数生长期的H9c2细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后，设对照组(完全培养基)、模型组、给药组(50、100μg·mL-1甘青青兰多糖)。给药组细胞先加入相应剂量的甘青青兰多糖预处理12 h,随后模型组和给药组加入终浓度为1μg·mL-1的脂多糖共孵育24 h诱导心肌炎模型。使用TRIzol试剂提取各组RNA,取1μg逆转录成cDNA后，用SYBR Green进行荧光定量PCR检测，以β-actin为内参，采用2-△△Ct法计算甘青青兰多糖对H9c2心肌细胞中炎症小体NLRP3及炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10的mRNA相对表达量的影响。基因引物序列见表1。由图2A～图2C可知：脂多糖可显著诱导心肌细胞中NLRP3炎症小体的表达，诱导心肌细胞炎症；甘青青兰多糖可显著降低NLRP3炎症小体的表达(P<0.05)。脂多糖可显著上调心肌细胞中TNF-α、IL-1βmRNA的表达；甘青青兰多糖干预后，两者的表达水平显著降低。IL-10作为抗炎因子，在细胞对抗炎症的过程中分泌会增多。在图2D中，模型组中IL-10的mRNA的表达水平显著高于对照组；甘青青兰多糖干预后，与模型组比较，IL-10 mRNA的表达水平也显著升高。

表1内参及目的基因的RT-qPCR引物序列

图2甘青青兰多糖对炎症模型H9c2心肌细胞中的NLRP3(A)、TNF-α(B)、IL-1β(C)、IL-10(D)mRNA水平的影响

1.2.3对脓毒症小鼠心脏功能的保护

动物实验经江南大学医学伦理委员会批准。小鼠饲养于江南大学医学院实验动物中心屏障环境中，温度20～26℃,湿度40%～70%。将32只小鼠随机均分为对照组、模型组及甘青青兰多糖低(DTPL)、高(DTPH)剂量组。DTPL、DTPH组分别ig给予25、250 mg·kg-1甘青青兰多糖0.2 mL,对照组和模型组ig等量生理盐水。给药7 d后，一次性ip脂多糖10 mg·kg-1建立脓毒症小鼠模型。在给药前后和造模前后观察小鼠的皮毛、眼球情况和活动状态。在造模24 h后，将小鼠置预麻盒中，待麻醉后，取出放在小动物操作台上持续麻醉，用脱毛膏脱掉心脏部位毛发，分别使用B模式和M模式对小鼠左心室长轴进行高频超声成像。用超高频小动物超声成像系统检测小鼠的心脏功能，包括左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)。由图3可知：与对照组比较，脂多糖可显著降低小鼠的LVEF和LVFS,表明小鼠脓毒症造模成功。与模型组比较，DTPL组中LVEF和LVFS显著上调至接近对照组的水平，但在DTPH组中，LVEF和LVFS却无显著改善，说明DTPL对小鼠的心脏功能具有保护作用。

图3各组小鼠心脏M模式超声成像(A)、左心室射血分数(B)和左心室缩短分数(C)的比较

1.2.4对脓毒症小鼠血清中炎症因子及心肌酶表达水平的影响

将小鼠麻醉后，摘眼球取血。血液在室温下静置30 min后，以3×103 r·min-1离心10 min,取血清。按ELISA试剂盒说明书操作，检测血清中炎症小体NLRP3与炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-10的水平。根据心肌酶(CK、AST、LDH、cTnI)试剂盒说明书操作，检测血清中心肌酶的表达水平。由图4A～图4C可知：与对照组比较，模型组小鼠血清中NLRP3炎症小体的表达显著升高，TNF-α、IL-1β表达水平也随着NLRP3炎症小体的高表达而显著上调；与模型组比较，DTPL、DTPH组中NLRP3炎症小体、TNF-α、IL-1β的表达显著下调。IL-10在模型组中的表达高于高于对照组，但无显著性差异；DTPL、DTPH组中IL-10的表达水平显著高于模型组(图4D)。表明甘青青兰多糖可改善脓毒症导致的小鼠全身炎症水平。由图4E～图4H可知：脂多糖可显著增强心肌酶的活力，但DTPL组中心肌酶的活力显著降低。

图4甘青青兰多糖对小鼠血清中NLRP3(A)、TNF-α(B)、IL-1β(C)、IL-10(D)、cTnI(E)、AST(F)、CK(G)、LDH(H)表达的影响

1.2.5对脓毒症小鼠心脏、肝脏、肾脏组织的病理学影响

取小鼠心脏、肾脏和肝脏组织，用PBS溶液清洗干净后，置4%多聚甲醛溶液中固定24 h。进行梯度乙醇脱水、石蜡包埋、制作5μm厚度切片。组织切片依次经烤片、脱蜡、组织水化、苏木素染色3 min、盐酸酒精适当分化、伊红染色3 min、脱水、中性树胶封片后，于显微镜下观察并拍照。由图5可知：与对照组比较，模型组小鼠心肌中有明显的多核炎症细胞浸润，心肌细胞多出现空泡状改变；DTPL、DTPH组中，小鼠的心肌细胞排列整齐，未见炎症细胞浸润，心肌细胞空泡情况得到明显改善。模型组的肝脏组织中炎症细胞浸润明显，DTPL明显改善了炎症细胞浸润的情况，但DTPH组中肝脏组织中仍出现空泡和炎症细胞。与对照组比较，模型组肾脏组织中肾小球出现显著萎缩；DTPL组的肾小球萎缩情况得到显著改善，但DTPH组的肾小球及周围组织中却出现大量的空泡及炎症细胞聚集的情况。说明DTPL对小鼠的心脏、肝脏和肾脏具有保护作用。

图5小鼠心脏、肝脏和肾脏组织的HE染色图

1.2.6对脓毒症小鼠心肌组织中NLRP3、TNF-α、IL-1β表达的影响

将各组小鼠的心肌组织切片依次进行烤片、二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、柠檬酸抗原修复10 min、3%过氧化氢灭活10 min、BSA封闭15 min,置4℃冰箱中一抗孵育过夜，于37℃二抗孵育15 min、37℃SABC孵育20 min, DAB镜下显色，及时洗片终止显色，再进行苏木素染色3 min、脱水、中性树胶封片，置显微镜下观察并拍照。由图6可知：与对照组比较，模型组心肌组织中NLRP3炎症小体、TNF-α、IL-1β、IL-10的表达显著上调。与模型组比较，DTPL、DTPH组中NLRP3炎症小体、IL-1β、IL-10的表达显著下调；DTPL组中TNF-α的表达显著下调，而DTPH组中TNF-α的表达无显著性差异。表明甘青青兰多糖发挥了对心肌的保护作用。

图6小鼠心肌组织中NLRP3、TNF-α、IL-1β、IL-10的免疫组化染色图(A)及阳性表达的统计分析图(B)

1.2.7对脓毒症小鼠心肌细胞凋亡的影响

将心肌组织石蜡切片在60°C烘箱中烘烤1 h,切片脱蜡至水化后，滴加20μg·mL-1蛋白酶K孵育15 min。加入50μL TdT缓冲液(TdT酶-equilibration Buffer-label mix green-去离子水=1:10:5:34),于37℃烘箱中避光孵育1 h。用PBS清洗后，以含DAPI的封片剂封片，于荧光显微镜下观察并拍照，采用IPP 6.0图像软件进行阳性细胞计数，观察小鼠心肌细胞的凋亡水平。由图7可知：模型组的心肌细胞凋亡率显著高于对照组；与模型组比较，DTPL组的心肌细胞凋亡率显著降低；但在DTPH组中，心肌细胞的凋亡率虽有所下降，但与模型组比较无显著性差异。表明DTPL可抑制脓毒症导致的心肌细胞凋亡。

图7小鼠心肌组织的TUNEL染色图(A)和心肌细胞凋亡率分析(B)

1.2.8统计学分析

实验数据采用SPSS 20.0统计软件进行处理，多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用t检验。结果均以

表示，以P<0.05表示有统计学意义。

2、讨论

脓毒症性心肌损伤是脓毒症最严重也是最常见的并发症[4,5],有效治疗脓毒症心肌病不仅可改善患者的预后，还可改善机体其他器官的炎症水平，进而改善脓毒症引起的器官功能障碍。脓毒症会导致心脏成纤维细胞中的NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体被激活，进而促进炎症因子白细胞介素(IL)-1β等的释放[6]。因此，抑制NLRP3炎症小体的活化，可减轻脓毒症导致的心肌炎症和心肌细胞凋亡，恢复心脏功能[7]。IL-10是机体产生的主要抗炎因子，对全身炎症反应综合征的平衡具有双向调节作用，在脓毒症进程中起重要的负调节作用[8]。IL-10可通过降低早期脓毒症中炎性细胞因子的水平来抑制炎症级联反应[9]。这种作用可能是通过抑制脂多糖诱导激活的免疫细胞释放炎症细胞因子来实现的。IL-10也能够抑制巨噬细胞向M1型转化，抑制炎症细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α等的分泌，减轻炎症反应。文中结果表明：经甘青青兰多糖干预后，脂多糖诱导的心肌炎小鼠心肌组织中NLRP3炎症小体的活化水平得到抑制，炎症因子IL-1β和肿瘤坏死因子-α的表达降低，抗炎因子IL-10的表达升高，心肌细胞的凋亡率显著下降，心脏功能得到了改善。

参考文献:

[1]曹钰,柴艳芬,邓颖,等.中国脓毒症/脓毒性休克急诊治疗指南(2018)[J].感染､炎症､修复,2019,20(1):3-22.

[2]张玲,孙媛,高春华,等.红芪多糖对脂多糖诱导小鼠脓毒症心肌病的保护作用[J].中成药,2022,44(11):3488-3492.

[3]邱艳,李立敬,邓翔,等.甘青青兰多糖的抗炎､抗应激及镇痛的药效学研究[J].甘肃医药,2021,40(1):5-8.

[5]祁俊华,杨文敏.探讨NF-κB信号通路抑制剂保护脓毒症大鼠肠道物理屏障功能的研究[J].今日药学,2021,31(12):905-908.

[9]孙航,吴金海,赵菊馨,等.脓毒症患者血清IL-6､TNF-α､IL-10水平及其与预后的相关性[J].临床医学,2022,42(3):17-19.

基金资助:2022年中医学(藏医)博士点建设及中药学(藏药)博士点培育科研资助计划项目(BSDJS-22-21);藏医药“十四五”规划内涵建设项目(2023ZYYGH04);西藏藏医药大学校级科研项目(2022ZRYB11);

文章来源:次旦南卓,米玛,侯豹,等.甘青青兰多糖对脂多糖诱导小鼠脓毒症心肌损伤的保护作用[J].华西药学杂志,2024,39(03):279-284.