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经典型皮肤弹性过度综合征COL5A1基因突变分析
摘要：目的:明确一例经典型皮肤弹性过度综合征(classic Ehlers-Danlos syndrome, cEDS)散发病例基因突变位点，并回顾总结国内报道cEDS病例的临床遗传特征。方法:对先证者进行全外显子组测序，对先证者及其父母进行Sanger测序验证突变位点，并检索1982年以来国内报道cEDS的所有文献。结果:先证者COL5A1基因第6号外显子发生杂合缺失突变：c.922delG(p.E308Rfs*3),其父母该位点无变异。文献检索到12例cEDS突变病例，11例携带COL5A1基因突变，1例携带COL5A2基因突变。结论:上述COL5A1基因突变为新的突变位点。
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皮肤弹性过度综合征(Ehlers-Danlos syndrome, EDS)是一组少见的遗传性结缔组织疾病[1,2],经典型皮肤弹性过度综合征(classic Ehlers-Danlos syndrome, cEDS)是最常见的一种类型，约占所有EDS病例的80%,发病率约为1/20000。cEDS主要表现为皮肤弹性过度、全身性关节过度活动和萎缩性瘢痕等[3],目前认为由COL5A1、COL5A2或COL1A1基因突变引起[3],COL5A1基因突变约占所有突变比例的75%～78%[3,4]。本文报道了1例散发的中国汉族cEDS患者，并总结了既往国内报道的cEDS临床特征和突变情况，为临床医生诊断cEDS提供参考。
1、资料与方法
1.1 临床资料
先证者为34月龄男童，自会行走时起碰撞后易出现瘀斑，皮肤外伤后愈合缓慢，易留萎缩性瘢痕，伴有皮肤松弛。先证者34周+早产出生，出生后有脐疝病史，现已完全治愈。否认类似的皮肤弹性过度家族史。体格检查：全身多处瘀斑、陈旧性萎缩性瘢痕，皮肤松弛柔软，触摸有绒样感，拉起皮肤可过度伸展，放松后可恢复原状，手指掌指关节过度伸展。患者面部可见内眦赘皮、眼距增宽，鼻背宽而平，眼部与牙齿无相关异常(图1)。实验室检查：心脏彩超提示三尖瓣轻度反流。血小板计数以及血小板糖蛋白分析、凝血谱、凝血因子、血管性假血友病因子抗原测定均在正常范围内。组织病理：大腿处皮肤活检提示皮肤萎缩伴胶原纤维稀疏纤细，Masson染色阳性(图2)。初步诊断：皮肤弹性过度综合征。
1.2 基因检测方法
本研究获得浙江大学医学院附属儿童医院伦理委员会批准(编号：2022-IRB-046),遵循《赫尔辛基宣言》实施。本研究获得了所有参与者的知情同意。采集先证者及其父母的血样各2 mL(2%乙二胺四乙酸抗凝),采用TIANamp血液DNA试剂盒提取基因组DNA。先证者样本使用Illumina HiSeq 4000平台进行全外显子组测序(Whole Exome Sequencing, WES),测序原始数据处理后与GRCh37/hg19人类参考序列进行比对。根据全外显子组测序结果，采用Sanger测序对先证者的突变位点及其父母样本进行PCR扩增及测序验证。
1.3 文献检索方法
以“皮肤弹性过度”、“皮肤弹力过度”、“Ehlers-Danlos综合征”、“埃勒斯-当洛综合征”、“EDS”和“cEDS”为关键词，查阅Pubmed以及中国知网、万方数据库、维普数据库中报道的cEDS中国病例，共检索到相关文献36篇(1982年1月至2023年12月),对其临床特征及突变位点进行总结。
2、结果
2.1 遗传学分析
全外显子测序结果显示先证者(患儿)携带COL5A1基因第6号外显子c.922delG(p.E308Rfs*3)杂合突变。c.922delG移码缺失导致第308位谷氨酸(E)被精氨酸(R)取代，导致第310位出现终止密码子(TGA)(图3)。该突变属于功能变异(PVS1:该变异引起基因开放阅读框发生改变，导致蛋白功能改变),在神州基因组数据库、人类外显子数据库(ExAC)、参考人群千人基因组(1000G)和人群基因组突变频率数据库(gnomAD)中未见收录(PM2:该变异在正常人群数据库中未发现),为一种新发突变(PM6:该变异为未经双亲亲缘关系验证的新发变异),此外，先证者表型与既往cEDS患者的已知表型相符。根据美国医学遗传学与基因组学学会基因突变解读指南(ACMG)确定c.922delG突变具有极强致病性，等级为PVS1+PM2+PM6。其父母为野生型，均未发生突变。
图1 患儿临床表现
图2 患儿皮肤组织病理
图3 患儿基因检测结果及突变分析
图4 目前中国cEDS患者携带的COL5A1基因突变
2.2 文献总结
目前，文献共计报告了来自9个家系的27例家族性cEDS病例和28例散发病例，包括本例在内，共有56例患者获得详细的临床资料，男女比例为29∶27,平均发病年龄约2岁。1例为近亲婚配家庭出生，2例为早产。我们总结了中国cEDS患者的临床特点，发现与国外报道无明显差异。其中仅12例患者进行了基因检测，11例携带COL5A1基因突变，1例携带COL5A2基因突变(表1)。包括本例在内，仅发现来自3个家系及3个散发病例的6个COL5A1基因突变，同一家系患者突变位点相同，包括1个无义突变、3个缺失突变、1个错义突变和1个剪接位点突变(图4)。
3、讨论
EDS是一组以皮肤过度伸展、关节活动过度和组织脆性为特征的遗传性结缔组织疾病[2,4,5]。随着分子检测技术的发展，2017年国际EDSs分类中修订了EDS表型和EDS相关的致病基因，确定了包括19种不同基因的突变引起的13种EDS亚型的新分类标准[4],常染色体显性遗传的cEDS是最为常见的亚型。流行病学研究显示，cEDS的发病率在男女之间大致相等，且发病情况与种族无显著关联[6,7]。cEDS主要临床特征包括皮肤过度伸展、广泛关节过度活动和易形成萎缩性瘢痕。次要临床特征包括皮肤柔软、容易出现瘀斑，以及皮肤脆弱性增加导致的易受伤。此外，患者还可能表现出软疣状假瘤、皮下结节、腹壁疝和内眦赘皮等症状。cEDS患者还可伴有关节过度活动的并发症如易扭伤、脱臼、关节疼痛、扁平足等(表2)[8,9]。本例患者表现出皮肤弹性过度、关节活动过度、萎缩性瘢痕、皮肤易发生瘀斑、内眦赘皮，符合cEDS的临床分类标准(表2)。
cEDS患者皮肤活组织病理检查可见真皮中含有大量不规则的胶原纤维，电镜下可见典型的“花椰菜”样胶原纤维改变，表明cEDS患者胶原纤维的生成紊乱[10,11]。目前认为，cEDS主要致病机制为基因突变致V型胶原缺陷。V型胶原是许多结缔组织中形成胶原纤维的一种蛋白，与I型胶原共同组装形成异型纤维。已知存在几种V型胶原的同种型，最常见的是[α1(V)]2α2(V)异三聚体，其中α1(V)和α2(V)链分别由COL5A1和COL5A2基因编码。截至目前，HGMD数据库共报道了221个与cEDS相关的COL5A1突变，其中错义/无义突变94个(42.5%),剪接突变49个(22.2%),缺失突变45个(20.4%),重复突变27个(12.2%),插入突变6个(2.7%)。突变分布于整个基因，包括信号肽(外显子1,2.3%)、N-前肽(外显子2-13,27.2%)、三螺旋结构域(外显子14-61,62.4%)和C-前肽(外显子62-66,8.1%)。目前研究表明，COL5A1中的甘氨酸取代在三螺旋结构域的C端明显聚集[12],提示为可能的热点突变区域。我们回顾文献总结中国cEDS病例的6个COL5A1基因突变，主要分布在COL5A1的前三个结构域，均会对三螺旋结构域的功能产生影响。本例突变位于三螺旋区域结构域之前，提前出现的终止密码子可能会引起无义介导的mRNA降解导致mRNA单倍体不足或者产生功能缺失的截断蛋白，使正常V型胶原的合成量降低约一半，与文献报道一致。本例突变位于第6外显子，c.922delG突变导致自308位氨基酸开始，其后序列发生改变。通过与人、鼠等物种的COL5A1蛋白进行保守性分析，发现308位点及其相邻序列非常保守，提示该位点突变对蛋白功能影响较大(图3c),确如本例患者病理组织活检所示，其大腿皮肤组织胶原纤维改变，提示胶原缺陷。
表1 自1982年报道的55例中国cEDS病例及本例患者的临床特征及基因突变总结
表2 经典型Ehlers-Danlos综合征临床诊断标准[7]
cEDS临床表现多样，具有明显的异质性。Colombi等[13]研究了62例cEDS患者的临床表型，发现皮肤弹性过度、关节活动过度和萎缩性瘢痕为最常见的临床特征。Colman等[14]研究了168例先证者和65例患病亲属，发现先证者主要临床标准的符合率明显高于其患病亲属。我们的文献回顾亦提示国内cEDS患者同样具有临床表型异质性，过于严格的临床标准可能会导致cEDS诊断不足。目前尚未发现cEDS基因型与表型的相关性，尽管与携带COL5A1突变的患者相比，携带COL5A2突变的患者数量有限，但有研究发现，COL5A2突变的患者表型更严重[15],腹主动脉瘤的发生率和严重程度增加，可引起主动脉弓破裂和夹层[16],可能与COL5A2致病突变影响其结构完整性，导致α2(V)链缺陷相关[17]。我们回顾文献总结中国cEDS患者仅发现7个突变报道，样本量过少，还需增加样本量进行基因型-表型相关性研究。目前cEDS暂无治愈的方法，尽早结合基因检测进行诊断有利于cEDS的早期干预和遗传咨询。
综上所述，我们报道一例散发中国cEDS患者的COL5A1基因第6号外显子c.922delG(p.E308Rfs*3)杂合移码突变，这一点突变是国内外首次报道。目前中国报道的cEDS患者仅9个家系和28例散发，可能与对本病认识不足有关，因此，皮肤科医师在临床诊疗中发现疑似患者症状时应注意鉴别。
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基金资助:浙江省自然科学基金(编号:LTGD23H110001);
文章来源:何淑女,张玲燕,刘吉鹏,等.经典型皮肤弹性过度综合征COL5A1基因突变分析[J].中国麻风皮肤病杂志,2024,40(08):538-544.
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