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心火脾虚证型特应性皮炎患者汗液差异代谢物及相关通路分析

2024-09-07 39 上传者：管理员

摘要：目的探究心火脾虚证型特应性皮炎(AD)患者汗液差异代谢物与相关通路。方法招募心火脾虚证型特应性皮炎患者与健康志愿者各22例。对所收集的汗液标本进行广泛靶向代谢组学检测，通过多元统计分析筛选出差异代谢物。利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库、人类代谢组数据库(HMDB)对差异代谢物进行相关通路与关联疾病分析。结果在两组汗液标本间，共筛选出115个差异代谢物。经KEGG数据库注释分析，共涉及15个通路。HMDB关联疾病分析结果提示与消化系统疾病关系密切，包括结直肠癌、嗜酸性食管炎、克罗恩病和溃疡性结肠炎。结论心火脾虚证型特应性皮炎患者与健康对照组间存在众多差异代谢物，可为共病临床早期预警提供线索。

关键词：
代谢组学
心火脾虚
汗液
特应性皮炎
皮肤干燥
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特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)作为最常见的炎症性疾病之一，临床表现为皮肤干燥、红斑、丘疹与渗出性病变，伴有皮肤持续瘙痒[1]。其发病机制十分复杂，遗传背景、外环境、表皮屏障缺陷、微生态失衡、免疫失调与皮肤炎症均参与了特应性皮炎的发病[2]。目前发现，特应性皮炎患者常有出汗减少的症状[3],可能与自主神经系统失衡、焦虑状态、过敏性炎症、组胺抑制乙酰胆碱从而减少出汗等因素有关[4-5]。此类患者除了面临体温升高、皮肤干燥的困扰外，热环境下还会出现皮肤刺痛感[6]。

中医理论认为，特应性皮炎发病是由于先天禀赋不足，与现代医学中对“特应性”的理解相一致。心火脾虚作为特应性皮炎的主要病机贯穿病程始终，在长期临床实践与科学研究中，此证型已被广泛接纳并应用于临床[7-9]。本研究以心火脾虚证型特应性皮炎患者为研究主体，以健康志愿者作为对照，分析两组受试者汗液标本中的差异代谢物以及相关通路，尝试为特应性皮炎的诊疗提供新的研究思路。

1、资料与方法

1.1研究对象

招募2021年8月—2021年12月于广东省中医院皮肤科门诊就诊的心火脾虚证型特应性皮炎患者22例，同时招募健康志愿者22例作为对照组。本研究经广东省中医院伦理委员会审批(YF2021-185-01)。

1.2诊断标准

所纳入特应性皮炎患者均符合Williams诊断标准[10]。心火脾虚证候诊断标准参考《中医病证诊断疗效标准》(国家中医药行业标准)和《特应性皮炎中医诊疗方案专家共识(2013版)》。患者由2位主治及以上职称皮肤科中医师诊断。

1.3纳入标准

特应性皮炎组：①符合诊断标准的特应性皮炎患者；②年龄6～18岁，近1年居住地为广东；③自愿参加本研究并签署知情同意书(监护人同时签署)。健康对照组：①正常体检的健康人群；②年龄6～18岁，近1年居住地为广东；③饮食、睡眠及排便情况基本正常；④近1个月无疾病就诊史。

1.4排除标准

①妊娠、哺乳期妇女；②合并有严重原发性疾病或处于感染性疾病急性期患者；③合并恶性肿瘤或存在其他脏器功能不全者；④存在水、电解质及酸碱平衡紊乱的患者；⑤48 h内使用非甾体类解热镇痛药的患者，2周内外用糖皮质激素及免疫抑制剂治疗的患者，4周内系统使用过糖皮质激素的患者，12周内系统使用过益生菌、抗生素、免疫抑制剂的患者；⑥便秘、多汗症患者或使用控制出汗药物的患者；⑦参加其他临床试验者。

1.5临床资料收集

收集并记录所有受试者的基线数据，包括性别、年龄、居住地、居住环境、过敏史等。

1.6汗液标本采集

受试者进行适当运动15 min后，研究者使用2 mL无菌注射器抽取汗液贴片空腔中所收集汗液，转移至2 mL冻存管中，使用液氮罐运输至广东省中医药生物资源中心，保存于-80℃冻存环境中。

1.7代谢物检测分析

1.7.1实验材料

超高效液相色谱(ExionLC AD,AB SCIEX);四级杆飞行时间质谱(TripleTOF 6600, AB SCIEX);串联质谱(QTRAP®,AB SCIEX)。甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯；标准品：二甲基亚砜(DMSO)或甲醇作为溶剂溶解后，-20℃保存，质谱分析前用70%甲醇稀释成不同梯度浓度。

1.7.2样品处理

取解冻后标本涡旋10 s混匀，移取200μL标本，加入20%乙腈甲醇内标提取液200μL,涡旋3 min,置于4℃、12 000 r/min离心10 min,离心后取全部上清液浓缩干燥。在干粉中加入200μL 70%甲醇水溶液复溶，涡旋3 min,冰水浴超声10 min。最后将样品置于4℃、12 000 r/min离心3 min,取150μL上清液到对应进样瓶中，用于上机分析。所有样品另取10μL混合为质控(QC)样品上机检测，上述步骤均于冰上操作。

1.7.3代谢物定性与定量检测

将所有汗液样本提取液等量混合，进行液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(LC-QToF-MS/MS)检测。利用三重四极杆质谱的多反应监测模式分析完成代谢物定量检测。

1.7.4标本质控分析

检测过程中，每10个检测分析样本中添加1个质控样本，用于监测分析过程的重复性。

1.8数据处理与统计学方法

1.8.1数据分析

临床资料数据使用SPSS26.0统计软件进行分析。质谱数据使用软件Analyst 1.6.3处理。采用主成分分析(principal component analysis, PCA)与正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)对两组进行差异代谢物分析。基于OPLS-DA结果筛选差异代谢物，筛选标准：①fold change≥2或fold change≤0.5;②变量重要性投影(variable importance in projection, VIP)≥1且P<0.05。

1.8.2通路注释与富集分析

利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库、人类代谢组数据库(HMDB)进行标志物鉴定、注释，对差异代谢物进行KEGG通路富集分析，利用HMDB识别关联疾病。

2、结果

2.1一般资料

两组年龄、性别、居住地、居住环境的差异无统计学意义(P>0.05),过敏史的差异有统计学意义(P<0.05),特应性皮炎组过敏史阳性率为54.55%,明显高于健康对照组，见表1。

表1特应性皮炎组和健康对照组基线情况例(%)

2.2标本质控结果

对5个质控样本质谱检测分析的总离子流图(TIC图)进行重叠展示分析(图1),曲线重叠性高，保留时间和峰强度均一致，表明本次质谱分析具有数据可靠性、可重复性与高稳定性。

2.3汗液代谢物检测结果

通过广泛靶向代谢技术分析，共检测出1 755个代谢物。对汗液样本检测代谢产物进行PCA(图2a)并建立OPLS-DA模型(图2b)。对OPLS-DA模型进行Permutation检测(图3),解释率为0.926,预测率为0.778,提示本模型拟合度佳。

2.4差异代谢物筛选结果

基于OPLS-DA模型共筛选得到两组间差异代谢产物115种，其中95个表达上调，20个表达下调，表达上调的前5位为：1-Palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、Genipin 1-gentiobioside、L-tyrosine methyl ester 4-sulfate、Adonixanthin、O-Acetylcypholophine,表达下调的前5位为：Pheniramine、Butachlor、Pyridine-2-azo-p-dimethylaniline、Praziquantel、N-([3-(Aminomethyl)phenyl]methyl)-ethanimidamide dihydrochloride,根据结果绘制火山图(图4)。

2.5通路注释与富集分析结果

选用KEGG数据库对统计筛选出的差异代谢物进行注释分析，共涉及15个通路(图5),富集显著性前5名的通路为：泛醌和其他萜类醌生物合成、药物代谢-细胞色素P450、嘌呤代谢、类固醇激素生物合成与嘧啶代谢。

选择HMDB对差异代谢物进行注释并识别关联疾病，共识别出60个关联疾病，前5位依次为：结直肠癌、尿毒症、嗜酸性食管炎、克罗恩病与溃疡性结肠炎。

图1质控样本质谱检测总离子流图叠加图

图2特应性皮炎组与健康对照组汗液代谢产物PCA得分图和OPLS-DA得分图

图3特应性皮炎组、健康对照组汗液代谢产物OPLS-DA模型验证图

图4特应性皮炎组、健康对照组汗液差异代谢产物火山图

图5汗液差异代谢物差异丰度得分图

3、讨论

汗液是由小汗腺分泌的透明、无味、低渗体液，对人体具有保湿、平衡电解质、调节体温及免疫防御等作用[5]。除了前文所提及的出汗能力下降以外，特应性皮炎患者汗液成分(离子、乳酸、尿素与抗菌肽等)也有所改变[11]。无论是出汗减少，或是成分改变，都会加剧特应性皮炎患者皮肤炎症情况[12]。为探索特应性皮炎患者与健康人之间存在的汗液代谢差异，代谢组学技术开始被应用于特应性皮炎患者的汗液研究[13]。

本研究中，心火脾虚证型特应性皮炎组与健康对照组两组间的代谢物组间分离趋势明显，提示两组间具有显著差异。差异代谢物主要为苯及其衍生物、核苷酸及其代谢物、脂肪酰类与氨基酸及其代谢物。

差异代谢物中表达上调最显著的是1-Palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(PLPC),作为一种磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC),其表达上调可能与特应性皮炎表皮的氧化和线粒体应激相关[14]。PC可经鞘磷脂(sphingomyelin, SM)合成，在鞘脂酶的作用下SM水解为磷酸胆碱与神经酰胺，磷酸胆碱与二酰甘油合成PC。SM对维持皮肤屏障至关重要，并受JAK/STAT通路的调节[15]。作为SM的下游产物，特应性皮炎中的神经酰胺水平因鞘脂酶活性下降而降低[16],导致屏障功能受到干扰，从而引发免疫反应和炎症。亦有研究认为，特应性皮炎可能与PC-SM转酰基酶活性缺乏相关[17]。既往文献报道，特应性皮炎患者的皮损区皮肤与血清样本中PC水平升高[18-19],与本研究在汗液标本中的观测结果一致，考虑磷脂代谢可能在一定程度上参与了特应性皮炎的发病。由于本研究是观察性研究，无法判断标本中的差异代谢物是特应性皮炎的致病因素或是全身炎症的结果，因此PLPC作为一种潜在生物标志物，有待下一步的实验验证。

KEGG富集分析结果中显著性最高的是泛醌和其他萜类醌生物合成通路。泛醌，也称辅酶Q,具有抗氧化特性[20]。在食物不耐受和过敏儿童中，可能随着疾病进展出现继发性辅酶Q10缺乏症[21]。除泛醌外，此通路还包含维生素E的代谢。维生素E和辅酶Q10作为重要的抗氧化剂，参与免疫防御系统和上皮细胞增殖，被认为可以预防与改善特应性疾病[22-23]。但2019年一项研究发现，儿童特应性皮炎患者生育酚与辅酶Q10水平与健康对照组无明显差异[24]。

对相关疾病的观察与预测是特应性皮炎慢病管理中至关重要的一环，充分考虑特应性皮炎的所有潜在合并症对于实施以患者为中心和针对疾病的护理策略具有一定意义。HMDB关联疾病分析结果提示与消化系统疾病关系密切，包括结直肠癌、嗜酸性食管炎、克罗恩病与溃疡性结肠炎，与心火脾虚证型特应性皮炎粪便标本的代谢组学检测结果一致[25]。

结直肠癌作为全球第三大常见癌症[26],与特应性皮炎之间的相关性存在一定争议。部分研究认为，特应性皮炎与结直肠癌风险存在相关性，其机制可能与趋化因子升高有关[27-28]。而2023年韩国的大型队列研究[29]与2006年德国的病例对照研究[30]观察到特应性皮炎与结直肠癌的发生无关，甚至特应性皮炎患者患结直肠癌的风险有降低趋势。嗜酸性食管炎与特应性皮炎同属于2型炎症性疾病，多项研究表明，嗜酸性食管炎的发病与特应性皮炎密切相关，并认为嗜酸性食管炎是特应性进程的晚期表现[31-33]。二者关联的机制可能与原发性上皮屏障的缺陷[34-35]、神经免疫活性改变[36]相关。溃疡性结肠炎和克罗恩病归属于炎症性肠病，2023年一项英国大型人群队列研究发现，特应性皮炎患者患炎症性肠病的风险增加[37],且孟德尔随机化研究验证了特应性皮炎与炎症性肠病的因果关系[38],其机制可能与遗传和环境因素、免疫细胞激活以及皮肤和肠道微生物群的改变相关。

中医理论认为，汗液与心的功能关系十分密切。基于此推断，心火脾虚证型特应性皮炎患者的汗液标本中代谢特征可能更为显著。证候作为中医理论的核心要素，其生物学基础不清、病证关联机制不明是影响中医药走向现代化、国际化的瓶颈。因此，针对证候与疗效的客观化、标准化研究十分重要。通过采用与证候复杂性和整体性相适应的科学理论及思维方法，如系统生物学技术对其进行研究，有助于科学阐释心火脾虚这一证候的本质。

本研究借助广泛靶向代谢组学技术，首次对中国特应性皮炎患者汗液标本进行研究，筛选出心火脾虚证型特应性皮炎患者汗液标本的差异代谢物，通过注释分析得出关联通路与疾病，为后续心火脾虚证型与特应性皮炎汗液标本的研究提供了新的参考。由于多方面因素，本研究存在一定不足之处：一方面，纳入患者例数较少，仅得出探索性研究结论，后续研究可按不同病情(轻、中、重)纳入以分层分析；对照组的设置未充分体现心火脾虚这一证型与其他中医证型的差异，后续实验设计中应增设非心火脾虚证型特应性皮炎患者。另一方面，由于目前汗液标本无公认、简便的收集方法，本研究经查阅多项研究并结合自身条件制定汗液采集方法，在后续研究中可进一步优化。

基金资助:国家中医药管理局中医学术流派传承工作室建设项目(LP0119045);国家中医药管理局中西医结合与少数民族医药司政府采购服务项目(2023376); 广州市科技计划项目(202201020333,2023B03J0562);

文章来源:王家爵,谢凌峰,莫秀梅,等.心火脾虚证型特应性皮炎患者汗液差异代谢物及相关通路分析[J].中国皮肤性病学杂志,2024,38(09):975-981.