妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus,GDM）是指妊娠前糖代谢正常，但妊娠期首次发现糖耐量异常的一种常见妊娠并发症[1]。GDM的病因和发病机制十分复杂，可能与遗传、环境、胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能障碍和胎盘泌乳素生成等多种因素有关[2]。随着当代女性育龄、饮食模式和生活方式的改变，GDM的发病率逐年增加，若GDM患者未得到及时治疗，可能会产生不良结局，如妊娠高血压和早产、死产、巨婴等[3]。因此，早期诊断和及时治疗策略对降低GDM患者不良结局至关重要，然而目前临床尚缺乏有效的GDM治疗药物。

研究指出，作为母体和胎儿循环之间的桥梁，胎盘对母体激素分泌、炎症反应和代谢调节具有一定影响[4]。滋养层细胞是胎盘屏障的主要组成部分，是母体与胎儿之间的首道屏障，其增殖、迁移、侵袭和凋亡与胎盘和胎儿的正常发育密切相关，其生物学功能受母体血糖的直接影响[5]。可见，增强滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭功能可能是GDM治疗的潜在手段之一。

吴茱萸碱是从中药吴茱萸中提取的一种生物碱活性物质，除抗炎、抗感染、抗肿瘤、保护神经作用外，还具有一定的降血糖活性，可缓解糖尿病大鼠的高血糖，并减轻其胰岛素抵抗，缓解肝脏、胰腺、肾脏的病理损伤[6]，但吴茱萸碱能否缓解GDM尚未可知。晚期糖基化终末产物（advanced glycation end product,AGE）是在非酶条件下，由大分子物质（包括蛋白、脂质和核酸）的游离氨基与还原糖的醛基发生一系列反应所生产的一种异质分子，可通过与其受体（receptor for advanced glycation end product,RAGE）结合而促进氧化应激和炎症反应的发生[7]。研究发现，AGE/RAGE信号通路的激活与机体慢性高血糖环境有关，当该通路受到抑制时，GDM大鼠的空腹血糖、空腹胰岛素、高密度脂蛋白水平均可显著改善，提示AGE/RAGE信号通路在GDM发生发展中具有重要作用[8]。此外，有研究指出，吴茱萸碱可通过调控AGE/RAGE信号通路而抑制口腔鳞癌细胞的恶性生物学行为[9]。基于现有证据，本研究拟在高糖环境下培养人滋养层细胞HTR-8/SVneo，初步探讨吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞增殖、迁移、侵袭的影响及潜在机制，旨在为GDM的治疗及吴茱萸碱的应用提供参考。

1、材料

1.1主要仪器

本研究所用主要仪器包括Synergy H1型酶标仪（美国Bio Tek公司）、VHX-7000型光学显微镜（日本KEYENCE公司）、FACS Calibur型流式细胞仪（美国BD Biosciences公司）、ABI Prism®7500型定量实时聚合酶链式反应（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）仪（美国ABI公司）、Gel Doc EZ型凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）等。

1.2主要药品与试剂

吴茱萸碱对照品（批号B6398，纯度≥98%）购自北京康瑞纳生物科技有限公司；AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（批号70-AP101）购自杭州联科生物技术股份有限公司；TRIzol试剂（批号EZB-TZ1）购自上海海方生物技术有限公司；PCR扩增试剂盒（批号XY0122）购自上海信裕生物科技有限公司；反转录试剂盒（批号K1622）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；兔AGE多克隆抗体（批号ab23722）、兔RAGE多克隆抗体（批号ab37647）、兔磷酸化核因子κB p65(phosphorylated nuclear factor-κB p65,p-NF-κB p65）单克隆抗体（批号ab76302）、兔NF-κB p65单克隆抗体（批号ab16502）、兔基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2）单克隆抗体（批号ab92536）、兔MMP-9单克隆抗体（批号ab76003）、鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体（批号ab8245）和辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批号ab6721）均购自英国Abcam公司；DMEM培养基（批号abs9561）购自爱必信（上海）生物科技有限公司；Lipofectamine®2000转染试剂（批号YZ-11668）、高效RIPA裂解液（批号R0010）均购自北京索莱宝科技有限公司；CCK-8试剂、化学发光试剂（批号分别为C0038、P0018S）购自上海碧云天生物技术股份有限公司；pc-NC（阴性对照）和pc-RAGE（过表达RAGE）质粒由广州市锐博生物科技有限公司提供。

1.3细胞

人绒毛膜滋养层细胞系HTR-8/SVneo购自美国ATCC细胞库。

2、方法

2.1细胞培养与分组

将HTR-8/SVneo细胞接种于含10%胎牛血清、100U/m L青霉素、100μg/m L链霉素的DMEM培养基（以下简称“DMEM完全培养基”）中，于37℃、5%CO2条件下培养（培养条件下同），每2～3 d换液1次，待细胞生长至对数期时进行实验。

将处于对数生长期的HTR-8/SVneo细胞分为对照组、高糖组、吴茱萸碱低浓度组、吴茱萸碱高浓度组、pcNC组、pc-RAGE组，每组设置6个复孔。对照组细胞加入含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM完全培养基；高糖组细胞加入含25 mmol/L葡萄糖的DMEM完全培养基（葡萄糖浓度参考相关文献[10]设置）；吴茱萸碱低、高浓度组细胞分别加入含25 mmol/L葡萄糖+2μmol/L吴茱萸碱或含25 mmol/L葡萄糖+4μmol/L吴茱萸碱的DMEM完全培养基（吴茱萸浓度参考本课题组前期预实验和相关文献[11]设置）；pc-NC组和pc-RAGE组细胞分别使用Lipofectamine 2000转染试剂转染pc-NC和pc-RAGE质粒（经q RT-PCR法检测，若pc-RAGE组细胞中RAGE m RNA表达较吴茱萸碱高浓度组和pc-NC组显著升高，则提示转染成功），再加入含25 mmol/L葡萄糖+4μmol/L吴茱萸碱的DMEM完全培养基。

2.2细胞存活率检测

采用CCK-8法检测。取对数生长期细胞，按“2.1”项下方法分组、处理，并设置不含细胞、不含药物的空白组。培养24 h后，每孔加入CCK-8试剂10μL，于37℃下孵育2 h，使用酶标仪于450 nm波长处检测各孔的吸光度（A）值，并按下式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%。

2.3细胞凋亡情况检测

采用流式细胞术检测。取对数生长期细胞，按“2.1”项下方法分组、处理。培养24 h后，收集细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，加入binding buffer 100μL重悬；随后，依次加入AnnexinⅤ-FITC染液5μL和PI染液5μL，于室温下避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.4细胞迁移能力检测

采用划痕实验检测。取对数生长期细胞，培养，待其融合至90%后，用200μL移液器枪头在各孔底部中央划一直线，用PBS清洗后，将细胞按“2.1”项下方法分组、处理。分别于培养0、24 h时使用显微镜观察各组细胞的划痕宽度，并按下式计算划痕愈合率：划痕愈合率（%）=（0 h时的划痕宽度-24 h时的划痕宽度）/0 h时的划痕宽度×100%。

2.5细胞侵袭能力检测

采用Transwell实验检测。取对数生长期细胞，以不含血清的DMEM培养基重悬，制成5×105个/m L的单细胞悬液。取上述单细胞悬液0.25 m L，接种于预先用基质胶处理5 h的Transwell小室上层；取含10%胎牛血清的DMEM培养基600μL，置于小室下层。上室细胞按“2.1”项下方法分组、处理。培养24 h后，收集穿膜细胞，用4%多聚甲醛固定20 min，再以0.1%结晶紫染液染色10 min，使用显微镜观察侵袭细胞（呈紫色）并计数。

2.6细胞中相关m RNA表达检测

采用q RT-PCR法检测。取对数生长期细胞，按“2.1”项下方法分组、处理。培养24 h后，收集细胞，使用TRIzol试剂提取其总RNA，检测其纯度和浓度后，使用反转录试剂盒将RNA反转录为c DNA，然后以此c DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系包括SYBR®Pre‐mix Ex TaqTM(2×）10µL、PCR正向引物（10µmol/L)0.8µL、PCR反向引物（10µmol/L)0.8µL、c DNA(200 ng/μL)2µL和无菌水6.4µL。PCR反应条件为：94℃预变性5min;94℃变性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸2 min，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法分析AGE、RAGE、NF-κB p65、MMP-2、MMP-9 m RNA的表达水平，结果以对照组为参照进行归一化处理。PCR引物序列及产物长度见表1。

表1 PCR引物序列及产物长度  

2.7细胞中相关蛋白表达检测

采用Western blot法检测。取对数生长期细胞，按“2.1”项下方法分组、处理。培养24 h后，收集细胞，用RIPA裂解液提取总蛋白，以BCA法测定蛋白浓度后进行加热变性。取变性蛋白，经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h；洗膜后，加入AGE、RAGE、p-NF-κB p65、NF-κB p65、MMP-2、MMP-9、GAPDH一抗（稀释比例均为1∶1 000），于4℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为1∶2 000），于室温下孵育2 h；使用化学发光试剂显色并置于凝胶成像仪下成像。以GAPDH为内参，使用Image J软件量化AGE、RAGE、MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平，并记录p-NF-κB p65与NF-κB p65蛋白的条带灰度值比值（即NF-κB p65蛋白的磷酸化水平）。

2.8统计学方法

使用Graph Pad Prism 9.0软件对数据进行统计分析。数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05。

3、结果

3.1吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞存活率的影响

与对照组[（98.14±4.18）%]比较，高糖组细胞的存活率[（67.32±3.42）%]显著降低（P<0.05）；与高糖组比较，吴茱萸碱低、高浓度组细胞的存活率[（78.59±3.67）%、（88.25±3.85）%]均显著升高，且吴茱萸高浓度组的改善效果显著优于低浓度组（P<0.05）；与吴茱萸碱高浓度组和pc-NC组[（87.69±3.73）%]比较，pcRAGE组细胞的存活率[（80.41±3.54）%]显著降低（P<0.05）。

3.2吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞凋亡的影响

与对照组[（3.76±0.27）%]比较，高糖组细胞的凋亡率[（21.64±2.19）%]显著升高（P<0.05）；与高糖组比较，吴茱萸碱低、高浓度组细胞的凋亡率[（16.13±1.73）%、（9.42±1.28）%]均显著降低，且吴茱萸高浓度组的改善效果显著优于低浓度组（P<0.05）；与吴茱萸碱高浓度组和pc-NC组[（10.38±1.32）%]比较，pc-RAGE组细胞的凋亡率[（14.97±1.54）%]显著升高（P<0.05）。结果见图1。

图1吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞凋亡的影响 

3.3吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞迁移和侵袭能力的影响

与对照组比较，高糖组细胞的划痕愈合率和侵袭数均显著降低（P<0.05）；与高糖组比较，吴茱萸碱低、高浓度组细胞的划痕愈合率和侵袭数均显著升高，且吴茱萸高浓度组的改善效果显著优于低浓度组（P<0.05）；与吴茱萸碱高浓度组和pc-NC组比较，pc-RAGE组细胞的划痕愈合率和侵袭数均显著降低（P<0.05）。结果见图2、图3、表2。

3.4吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞相关m RNA表达的影响

与对照组比较，高糖组细胞AGE、RAGE、NF-κB p65 m RNA的表达水平均显著升高，MMP-2、MMP-9m RNA的表达水平均显著降低（P<0.05）；与高糖组比较，吴茱萸碱低、高浓度组细胞AGE、RAGE、NF-κB p65m RNA的表达水平均显著降低，MMP-2、MMP-9 m RNA的表达水平均显著升高，且吴茱萸高浓度组的改善效果显著优于低浓度组（P<0.05）；与吴茱萸碱高浓度组和pc-NC组比较，pc-RAGE组细胞RAGE、NF-κB p65m RNA的表达均显著上调，MMP-2、MMP-9 m RNA的表达均显著下调（P<0.05）。结果见表3。

图2吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞迁移能力的影响（划痕实验）

图3吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞侵袭能力的影响（Transwell实验） 

表2吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞迁移和侵袭能力的影响（,n=6)  

表3吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞相关m RNA表达的影响（,n=6)  

3.5吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞相关蛋白表达的影响

与对照组比较，高糖组细胞AGE、RAGE蛋白的表达水平和NF-κB p65蛋白的磷酸化水平均显著升高，MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平均显著降低（P<0.05）；与高糖组比较，吴茱萸碱低、高浓度组细胞AGE、RAGE蛋白的表达水平和NF-κB p65蛋白的磷酸化水平均显著降低，MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平均显著升高，且吴茱萸高浓度组的改善效果显著优于低浓度组（P<0.05）；与吴茱萸碱高浓度组和pc-NC组比较，pcRAGE组细胞RAGE蛋白的表达水平和NF-κB p65的磷酸化水平均显著升高，MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平均显著降低（P<0.05）。结果见图4和表4。

图4吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞相关蛋白表达影响的电泳图  

表4吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞相关蛋白表达的影响（,n=6)  

4、讨论

研究发现，具有正常生物学功能的滋养层细胞对胎盘的发育至关重要，当滋养层细胞长期处于高糖环境时，其侵袭、迁移和增殖会受到抑制，进而导致孕妇流产和胎儿早产[10]。本研究通过在高糖环境下培养人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo以体外模拟GDM，结果显示，经高糖处理后，HTR-8/SVneo细胞的存活率和迁移、侵袭能力均较对照组显著降低或减弱，凋亡率较对照组显著升高，提示高糖环境会损伤HTR-8/SVneo细胞的生物学功能。

作为中药吴茱萸的活性成分之一，吴茱萸碱可减轻游离脂肪酸诱导的人脐静脉内皮细胞的炎症损伤，是治疗胰岛素抵抗和2型糖尿病的潜在药物[12]；而妊娠期胰岛素抵抗可导致胰岛β细胞功能障碍而使葡萄糖耐量受损，最终引发GDM[2]。此外，吴茱萸碱具有降血糖作用，能显著降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖，并有一定的胰腺、肝脏保护作用[13]。以上研究表明，吴茱萸碱可能是GDM的潜在治疗药物。另有研究显示，胎盘滋养层细胞侵袭子宫的行为受多因素的严格调控，其中MMP-2、MMP-9蛋白的合成和激活是必需环节，两者可显著增强滋养层细胞的侵袭能力[14]。本研究结果显示，经吴茱萸碱干预后，高糖诱导的HTR-8/SVneo细胞的存活率和迁移、侵袭能力均显著升高或增强，凋亡率显著降低，且MMP-2、MMP-9 m RNA及蛋白的表达均显著上调，提示该成分可减轻高糖条件下滋养层细胞的损伤，改善受损滋养层细胞的生物学功能。

AGE是由蛋白、脂质和核酸的游离氨基与还原糖的醛基发生非酶基化等一系列反应而产生的化合物。在糖尿病中，高血糖可导致AGE积累，激活AGE/RAGE通路，进而加剧高糖诱导的细胞功能损伤[15]；同时，活化的AGE可结合RAGE，进一步触发NF-κB介导的炎症反应，最终影响糖尿病大鼠的骨代谢[16]。另有研究发现，GDM产妇脐带血样品中AGE水平过高，是新生儿低血糖发生的危险因素[17]；同时，GDM孕妇血清样品中RAGE水平高于非GDM孕妇，提示该指标对孕妇发生胰岛素抵抗及不良妊娠结局具有一定临床指导价值[18]。本研究结果显示，在高糖环境中，HTR-8/SVneo细胞中AGE、RAGE蛋白及m RNA的表达水平、NF-κB p65m RNA的表达水平和NF-κB p65蛋白的磷酸化水平均显著升高，提示高糖环境会激活细胞中的AGE/RAGE信号通路。经吴茱萸碱干预后，HTR-8/SVneo细胞的上述指标均显著降低，与Dai等[8]的研究结果基本一致，提示吴茱萸碱可通过调节AGE/RAGE信号通路缓解高糖诱导的滋养层细胞功能损伤，促进其增殖、迁移和侵袭。为了进一步验证上述结果，本研究在HTR-8/SVneo细胞中转染pc-RAGE以过表达RAGE，结果显示，过表达RAGE会减弱吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞功能损伤的改善作用，初步证实了AGE/RAGE信号通路是吴茱萸碱发挥上述作用的潜在靶点。

综上所述，吴茱萸碱可促进高糖诱导的滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭，改善其功能损伤，上述作用与抑制AGE/RAGE信号通路有关。本研究初步从细胞层面研究了吴茱萸碱对GDM的保护作用，后续将通过体内动物实验基于AGE/RAGE信号通路深入探讨吴茱萸碱对GDM的改善作用及机制。

基金资助:山东省自然科学基金面上项目(No.ZR2022MH086);

文章来源:王丽娟,刘元涛,田鹏飞.吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞增殖､迁移､侵袭的影响及机制[J].中国药房,2024,35(12):1463-1468.