百里香酚（5-Methyl-2-Isopropylphenol）又名麝香草酚，常温下为无色晶体或无色结晶粉末，有百里草或麝香草的气味，其微溶于水，能溶于冰醋酸和石蜡油，也溶于乙醇、氯仿、乙醚和橄榄油。大量研究结果揭示了百里香酚有显著的抗菌效果[1,2]。Qiu等[3]的研究发现，百里香酚抑制金黄色葡萄球菌中α-溶血素、肠毒素A(Enterotoxin A,SEA）、肠毒素B(Enterotoxin B,SEB）的转录，导致其分泌量减少，从而降低了溶血和肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）的诱导活性。还有研究发现，百里香酚可以通过改变细胞膜通透性的形式[4]，促使病原微生物死亡，从而发挥其抗菌活性。与此同时，百里香酚有抗炎、抗真菌、抗氧化的特性，具有免疫调节的作用[5]。百里香酚对动物皮层和黏膜等组织有刺激作用，浓度过高时会损伤肝脏和肾脏，因此需谨慎使用，注意用量[6]。受环境等因素的限制，天然百里香酚的成本很高，而人工合成百里香酚仍存在许多问题，例如副产物太多、环境污染大、生产效率低等[7]。虽然百里香酚具有微毒、造价高等缺点，但因其优秀的抗菌、抗炎、抗真菌的特性，其在养殖行业的应用仍有较好的发展前景。

姜黄素（Curcumin）是从姜科、天南星科植物根茎中提取的多酚类物质，其结构主链由不饱和脂族及芳香族构成，易溶于二甲基亚砜、乙醇、氯仿等有机溶剂，在酸性p H下稳定，难溶于水。随着对姜黄素的深入研究，发现其具有抗炎、抗氧化、调脂、抗病毒、抗感染、抗肿瘤、抗凝、抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化等广泛的药理活性，且具有毒性低、不良反应小等优点[8,9,10,11]；姜黄素对疾病也具有广泛的预防特性[12]。研究表明，姜黄素对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用[13]，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌又是对人和动物机体有害的菌种，食用姜黄素将起到保健的作用，故姜黄素在养殖业中的应用具有较高的研究价值。

鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是禽类养殖业生产中常见的致病菌，具有较强的传染性和较高的发病死亡率，严重影响到中国养禽业的发展，对养禽业具有较大的危害[14,15,16]。现主要采用抗生素作为鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的治疗和预防药物。抗生素具有提高畜禽饲料转化效率、预防畜禽疾病、促进畜禽健康生长等功能，但随着抗生素长期且大量使用，其副作用日益凸显，如引起病原微生物产生抗药性，畜禽肠道菌群结构失衡、机体免疫力下降，破坏生态环境，危及人类健康等[17]。自抗生素面市以来，其在养殖业中的长期滥用已造成了一系列的显著危害，微生态制剂替代抗生素已成为畜牧业发展的必然趋势[18]。

百里香酚与姜黄素二者皆被证实具有广泛的抑菌和免疫作用[19]，且二者具有协同作用[20]，无明显毒副作用[21]，故二者联用具有替抗的潜质，在养殖行业具有广阔的应用前景。因此，本试验选取百里香酚与姜黄素联合用药，研究鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抑菌效果，探究百里香酚与姜黄素的最佳配伍比例。

1、材料与方法

1.1 主要试验药品和试剂

百里香酚（含量>98%）、姜黄素（含量>98%），购自成都瑞芬思生物科技有限公司；鸡白痢沙门氏菌标准菌株（ATCC13036）、金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC25923）、大肠杆菌标准菌株（ATCC29181），由四川农业大学动物医学院药学系实验室提供；LB营养琼脂、LB肉汤、SS营养琼脂、BP营养琼脂、麦康凯营养琼脂（简称MAC），均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；二甲基亚砜购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 主要试验仪器与设备

96孔细胞培养板；1 m L和200μL移液器（赛默飞世尔科技公司）；电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司）；YC-330型医用冷藏柜（青岛澳柯玛股份有限公司）；超净工作台（上海尚净实业有限公司）；101A-4型电热鼓风干燥箱（上海试验仪器厂有限公司）；DH-600A型电热恒温培养箱（北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂的配制

百里香酚药液和姜黄素药液的配制：用电子分析天平精确称量12.8 g百里香酚，以二甲基亚砜作为溶剂，于100 m L容量瓶中配制浓度为0.128 g/m L的百里香酚溶液；用电子分析天平精确称量12.8 g姜黄素，以二甲基亚砜作为溶剂，于100 m L容量瓶中配制浓度为0.128 g/m L的姜黄素溶液。

百里香酚联合姜黄素药液的配制：用电子分析天平精确称量，按照表1中的用量，以二甲基亚砜作为溶剂，于100 m L容量瓶中配制各种比例药液（药液浓度为0.128 g/m L）备用。

表1百里香酚联合姜黄素药液的配制  

1.3.2 标准菌株的复苏及分离培养

分别取3瓶装有LB肉汤的EP管，各加入1 m L解冻后的鸡白痢沙门氏菌标准菌株菌液、金黄色葡萄球菌标准菌株菌液和大肠杆菌标准菌株菌液，置于恒温培养箱中37℃培养16～24 h。

从EP管中蘸取鸡白痢沙门氏菌标准菌株菌液，接种在SS营养琼脂平板上培养16～24 h；从EP管中蘸取金黄色葡萄球菌标准菌株菌液，接种在BP营养琼脂平板上培养16～24 h；从EP管中蘸取大肠杆菌标准菌株菌液，接种在MAC营养琼脂平板上培养16～24 h。

从SS营养琼脂平板上挑取直径约1 mm、无色透明、光滑湿润、边缘整齐的单个菌落，接种于装有2 m L LB肉汤的EP管中；从BP营养琼脂平板上挑取直径2～3 mm、呈灰黑色至黑色、表面光滑、凸起、有光泽、有浅色边缘的单个菌落，接种于装有2 m L LB肉汤的EP管中；从MAC营养琼脂平板上挑取直径2～3 mm、呈鲜桃红色或微红色、菌落中心呈深桃红色、圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑、湿润的单个菌落，接种于装有2 m L LB肉汤的EP管中[22]。将装有单个菌落的EP管置于恒温培养箱中37℃培养16～24 h，制得3种供试纯净菌液。

1.3.3 细菌含量测定

用LB肉汤将上述菌液做10倍梯度稀释（0.5 m L菌液+4.5 m L LB肉汤）。取10-5、10-6、10-7这3个浓度梯度的菌液各0.1 m L滴在琼脂平板中央，轻轻拍打，使其均匀摊开，不要接触培养皿边缘，每个梯度做2个平板，放入37℃恒温箱培养16～24 h。

计算菌落数：挑选长有30～300个菌落的平板计数。2个平板的计数结果取平均值并计算细菌浓度，使生长浊度达9×108个/m L。计算示例：10-6的2个平板上生长菌落数分别为65、67个，平均66个/0.1 m L，则1 m L含活菌落数660×106个/m L，即生长浊度为6.6×108个/m L。

将供试菌液（3步制得）用肉汤做1∶10 000稀释（最终的浊度为10）。

1.4 扩散法探究联合用药抑菌能力

百里香酚与姜黄素联合用药时可能存在最佳配伍比例。使用扩散法，在相同药物浓度的情况下，通过测量抑菌圈的直径判断各配伍药方的抑菌能力。

从冰箱取出已提前制备的纯净菌种活化0.5 h，用肉汤稀释为106CFU/m L菌液置于EP管中，在手掌上轻轻拍打，使菌株充分混匀。使用移液器吸取浓度为106CFU/m L试验菌悬液100μL，将其接种在营养琼脂培养皿内，用涂布棒涂布均匀，盖好培养皿。对鸡白痢沙门氏菌进行试验时，使用SS营养琼脂平板；对金黄色葡萄球菌进行试验时，使用BP营养琼脂平板；对大肠杆菌进行试验时，使用MAC营养琼脂平板。

使用已消毒的打孔器对提前准备好的营养琼脂培养基中心打孔，与培养皿的周缘相距15 mm以上。打完孔后，用无菌针头将琼脂孔中的培养基挑出（每次无菌针头挑完后需在酒精灯火焰上灼烧灭菌）。用移液器吸取提前配制好的药液（7种比例，药液浓度为0.128 g/m L）或LB肉汤20μL，加到各种已打好孔的培养基中培养观察。

每种菌株重复3次试验。将完成接种细菌的培养基置于37°C恒温培养箱中，培养16～18 h观察结果。使用游标卡尺测量各抑菌圈的直径并做好记录。

1.5 联合用药抑菌浓度的测定

通过预试验初步确定百里香酚与姜黄素的最佳配伍范围后，采用等比例稀释法，进一步确认各种配伍的具体抑菌能力，测算最小抑菌浓度（MIC）。

在96孔培养板的第1列从上到下，依次加入配伍比例为1∶0、0∶1、1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1，浓度为0.128 g/m L百里香酚联合姜黄素药液100μL。对药物进行2倍浓度稀释，即第1孔中加入LB肉汤100μL后用移液器充分吹打（至少3次以上），使药物与肉汤充分混匀，然后吸取100μL加入第2孔，再充分吹打使之与药液充分混匀，同样吸取100μL加入第3孔中。照此重复直至最后一孔，吸取100μL弃去；此时每孔中的药物浓度从左到右依次为64 000、32 000、16 000、8 000、4 000、2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.3μg/m L，每孔中都有混合药液100μL。再往每孔中加入稀释好的菌液100μL，此时每孔中的药物浓度即最终药物浓度，从左到右依次为32 000、16 000、8 000、4 000、2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.3、15.7μg/m L，从左到右，编码记作Ⅰ至Ⅻ孔，此时每孔中都有混合药液200μL。同时，在另一块96孔块板上做1排阴性对照（仅加空白肉汤不加菌液）和1排阳性对照（加菌液肉汤不加药液）。

将加有药液和菌液的96孔培养板放入37℃恒温培养箱培养16～20 h后，观察并记录96孔板各孔的浑浊程度。在同一比例药液试验中，从各澄清孔中选择药液浓度最低的一孔，从中取菌液100μL均匀涂布在所匹配的营养琼脂培养基上，放入37℃恒温培养箱培养16～20 h后，观察并记录各平板上的菌落数，如果菌落数小于5则为有效数据，如果菌落数大于或等于5则为无效数据。鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌3种菌液各进行以上试验3次，减少误差，记录相关试验数据。

1.6 微量棋盘稀释法抑菌浓度的测定

通过扩散法和等比例稀释法的试验结果，确定最佳联用比例。最后通过棋盘法得到更精准的最小抑菌浓度（MIC）。

使用量程为1 000μL的移液器，从配制好的浓度为0.128 g/m L的百里香酚药液中取20.0 m L置于提前准备好的百里香酚Ⅰ号EP管中。使用移液器，从Ⅰ号EP管中移取10.0 m L至Ⅱ号EP管中，再使用移液器向Ⅱ号EP管中加入10.0 m L二甲基亚砜，充分吹打混匀。用此方式2倍稀释，最终得到置于Ⅰ至Ⅶ号EP管中百里香酚药液的浓度分别为128 000、64 000、32 000、16 000、8 000、4 000、2 000μg/m L。姜黄素药液的2倍稀释同上，最终得到置于Ⅰ至Ⅶ号EP管中姜黄素药液的浓度分别为128 000、64 000、32 000、1 600、8 000、4 000、2 000μg/m L。

取出提前准备好的96孔板，使用移液器向96孔板左侧8×8的64孔中各加入100μL提前准备好的菌液。取稀释好的百里香酚药液，向96孔板左侧8×8的64孔中各加入50μL药液，第1排到第7排加入的药液浓度依次是128 000、64 000、32 000、16 000、8 000、4 000、2 000μg/m L，第8排的8孔加入50μL的二甲基亚砜。取稀释好的姜黄素药液，向96孔板左侧8×8的64孔中各加入50μL药液，第1列到第7列加入的药液浓度依次是128 000、64 000、32 000、16 000、8 000、4 000、2 000μg/m L，第8列的8孔加入50μL的二甲基亚砜。在96孔板的右侧做1列阴性对照（仅加空白肉汤不加菌液和药液）和1列阳性对照（加菌液肉汤不加药液）。

将96孔培养板放入37℃恒温培养箱培养16～20 h后，观察并记录96孔板各孔的浑浊程度（记为浑浊或澄清）。从各澄清的孔中取100μL菌液，分别均匀涂布在对应的营养琼脂培养基上，放入37℃恒温培养箱培养16～20 h后，观察并记录各平板上的菌落总数是否小于5，小于5则有效，反之则无效。

1.7 百里香酚与姜黄素联合抑菌效果测算

常通过计算FIC指数判断药物联用的作用关系。当FIC指数≤0.5时，则2种药物呈协同作用；当0.5<FIC指数≤1.0时，则2种药物呈相加作用；当1.0<FIC指数≤2.0时，则2种药物呈无关作用；当FIC指数>2.0时，则2种药物呈拮抗作用。本试验中，判断百里香酚联合姜黄素FIC指数的计算式如下。

1.8 数据处理

所得试验数据均采用Excel 2017软件统计与处理。

2、结果与分析

2.1 扩散法探究联合用药抑菌能力的结果

于37℃恒温培养箱培养16～20 h后，从恒温培养箱中取出完成扩散法试验的平板（图1），使用刻度尺测量并记录每个抑菌圈的直径（mm），每组试验的具体数据见表2至表4。由表2至表4可知，百里香酚与姜黄素的配伍比为2∶1和3∶1时，平板上的抑菌圈直径较大，故初步判定，百里香酚与姜黄素的配伍比为2∶1和3∶1时，对鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抑菌能力较强。

图1扩散法试验结果 

2.2 联合用药抑菌浓度的测定结果

2.2.1 微孔板法抑菌结果

于37℃恒温培养箱培养16～20 h后，取出96孔板观察。在测定联合用药对鸡白痢沙门氏菌MIC的1号板上（图2），可见空白组Ⅰ至Ⅲ号孔为澄清状态，Ⅳ至Ⅻ号孔为浑浊状态，此时Ⅲ号孔为最低药物浓度澄清孔。对不同比例药物最低药物浓度澄清孔编号记录，见表5至表7。由表5至表7可知，百里香酚与姜黄素的配伍比为2∶1和3∶1时，最低药物浓度澄清孔编号数在Ⅶ至X，抑菌浓度较低，故初步判定，百里香酚与姜黄素的配伍比为2∶1和3∶1时，对鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抑菌能力较强。

表2不同比例配伍的联合药液在SS营养琼脂平板上形成的抑菌圈直径    

表3不同比例配伍的联合药液在BP营养琼脂平板上形成的抑菌圈直径  

表4不同比例配伍的联合药液在MAC营养琼脂平板上形成的抑菌圈直径 

从各组最低药物浓度澄清孔中吸取菌液，涂布平板培养以验证数据的有效性，记录各组最低药物浓度和数据有效性，结果见表8至表10。由表8至表10可知，百里香酚与姜黄素的配伍比为2∶1和3∶1时，澄清孔最低药物浓度在62.5～500.0μg/m L抑菌浓度较低，故初步判定百里香酚与姜黄素的配伍比为2∶1和3∶1时，对鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抑菌能力较强。

图2等比例稀释法测算MIC部分结果  

表5联合药液对鸡白痢沙门氏菌最低药物浓度澄清孔编号  

表6联合药液对金黄色葡萄球菌最低药物浓度澄清孔编号    

表7联合药液对大肠杆菌最低药物浓度澄清孔编号   

表8联合药液对鸡白痢沙门氏菌澄清孔最低药物浓度与平板菌落数    

表9联合药液对金黄色葡萄球菌澄清孔最低药物浓度与平板菌落数   

表1 0联合药液对大肠杆菌澄清孔最低药物浓度与平板菌落数

2.2.2 不同比例配伍对鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC

去除每组试验结果的无效数据后取平均值，获得MIC，结果见表11。由表11可知，百里香酚与姜黄素的配伍比为2∶1和3∶1时，对鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC较小，体外抑菌能力较强。

2.3 微量棋盘稀释法抑菌浓度的测定结果

2.3.1 微量棋盘稀释法试验结果

于37℃恒温培养箱培养16～20 h后，取出96孔板，观察各孔内药液的状态是否浑浊，结果见表12至表14。由表12至表14可知，在各96孔板上，明显可见其右下角存在长方形区域内各孔的药液为浑浊状态。此时，长方形左上角顶点的左上方一孔为最低药物浓度澄清孔，此孔药物浓度为相对应的MIC。  

表1 1不同比例配伍下对鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC    

表1 2棋盘法测定对鸡白痢沙门氏菌的抑菌效果   

表1 3棋盘法测定对金黄色葡萄球菌的抑菌效果    

表1 4棋盘法测定对大肠杆菌的抑菌效果

2.3.2 MIC测定结果

从鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌96孔板4列5排1孔中各取100μL菌液，分别均匀涂布在SS、BP和MAC营养琼脂培养基上，放入37℃恒温培养箱培养16～20 h后，发现平板上的菌落总数都小于5，故该孔药物浓度为MIC，都为300μg/m L。

3、小结与讨论

3.1 百里香酚与姜黄素的联合抑菌效果

将表11的数据代入式（1）后，计算得到在各预设比例配伍下，百里香酚联合姜黄素的FIC均小于等于0.5，故2种药物在此时呈协同作用。

3.2 百里香酚和姜黄素联用最佳比例探究

通过扩散法试验的结果可知，百里香酚与姜黄素的配伍比为2∶1和3∶1时，对鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抑菌能力较强。

通过完成不同比例配伍对鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC测定后，得出百里香酚与姜黄素的配伍比为2∶1和3∶1时，对鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC较小，体外抑菌能力较强。

市面上有一种具有抗菌作用的饲料添加剂中同时含有百里香酚和姜黄素2种成分，其质量百分含量为肉桂醛2.5%～3.5%、香芹酚1%～2%、百里香酚1%～2%、姜黄素0.5%～1.5%、柠檬酸钠45%～60%、丙二醇10%～20%、白炭黑15%～30%[23],其中，百里香酚与姜黄素的质量比为（2∶1)～(4∶3）。因该产品中加入了肉桂醛与香芹酚2种具有抗菌性质的药物，试验中应用了具有微毒性的二甲基亚砜[24]作为溶剂，这些因素都对测定百里香酚与姜黄素的配伍最佳联用比例产生一定的干扰，故试验结果测得最佳联用比2∶1和3∶1处于可信范围内。

当百里香酚与姜黄素的配伍比在2∶1或3∶1时，抑菌能力差异不大，但百里香酚具有微毒性，且造价昂贵，如果用于实际生产实践可能对安全问题和成本问题造成影响。从实践和安全来看，百里香酚与姜黄素的配伍比在2∶1时实用性更强，为对鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌体外抑菌的最佳联用比。

3.3 百里香酚联合姜黄素的体外抑菌效果

通过微量棋盘法试验获得了更加精准的MIC。当百里香酚与姜黄素的配伍比为2∶1时，以二甲基亚砜作为溶剂，对鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌体外抑菌的MIC都为300μg/m L。

作为对比，盐酸沙拉沙星、环丙沙星、硫酸新霉素、喹赛多等抗菌药对鸡白痢沙门氏菌的MIC都为5μg/m L以下[25,26]；喹赛多对金黄色葡萄球菌的MIC为2.5μg/m L[27]；头孢三嗪、丁胺卡那、头孢唑啉、庆大霉素等常见抗菌药对大肠杆菌的MIC约为250μg/m L[28]。现有几种正在使用的中药配伍饲料添加剂对鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌体外抑菌的MIC为0.6～0.9 mg/m L[29,30,31]。在抗生素广泛使用的今天，虽然百里香酚与姜黄素联合应用对鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌体外抑菌能力与上述抗菌药物具有较大的差距，但与实际生产中使用的饲料添加剂相比，体外抑菌能力具有较大的优势。而且百里香酚和姜黄素还具有较好的抗炎与促进免疫作用，且二者具有协同作用，可以研究开发用作饲料添加剂，投入实际应用，成为养殖业的替抗产品。

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基金资助:宜宾职业技术学院院级科研项目(ZRKY21YB-01);四川省科技厅科技扶贫专项-筠连县2021年科技特派员服务与创业项目(科技特派员)(2021ZHFP0064);

文章来源:阳刚,杨仕群,杜泽沛,等.百里香酚联合姜黄素的体外抑菌效果[J].中南农业科技,2024,45(06):37-43.