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NK细胞和Th17细胞在1型糖尿病儿童中的表达及临床意义

2024-07-11 16 上传者：管理员

摘要：目的研究1型糖尿病儿童中自然杀伤细胞(NK细胞)、辅助性T细胞17(Th17细胞)的表达及临床意义。方法选取2021年1月—2022年1月湖州市中心医院收治的1型糖尿病患儿46例作为研究组，健康体检的健康儿童50例作为对照组。获得所有研究对象外周血样本，测定并比较NK细胞、Th17细胞比例及细胞因子水平。分析NK细胞、Th17细胞在1型糖尿病儿童中的表达及相关性，研究对儿童1型糖尿病的预测价值。结果研究组NK细胞比例、NK细胞因子NKp46、perfprin水平均低于对照组[NK细胞比例：(5.12±0.94)%vs.(15.43±1.32)%;NKp46:(0.70±0.11)vs.(1.32±0.39);perfprin:(0.65±0.08)vs.(1.26±0.21)],差异均有统计学意义(t=43.740、10.400、18.500,均P<0.05)。研究组Th17细胞比例、Th17细胞因子白细胞介素-17A(IL-17A)、白细胞介素-23(IL-23)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平均高于对照组[Th17细胞比例：(2.34±0.32)%vs.(1.12±0.10)%;IL-17A:(6.88±1.12)pg/ml vs.(3.85±0.93)pg/ml; IL-23:(28.32±3.42)pg/ml vs.(17.85±2.11)pg/ml; IL-1β:(9.13±1.72)pg/ml vs.(7.65±1.00)pg/ml],差异均有统计学意义(t=25.640、14.460、22.640、5.204,均P<0.05)。相关性分析发现：NK细胞与Th17细胞呈负相关(r=-0.785,P<0.05)。logistic回归分析结果显示：糖化血红蛋白，空腹血糖，GAD-Ab, NK细胞，NK细胞因子NKp46、perfprin, Th17细胞，Th17细胞因子IL-17A、IL-23、IL-1β均为影响儿童1型糖尿病发生的因素(均P<0.05)。受试者工作特征(ROC)曲线显示：与单项检测相比，多项联合检测的预测效能最优，曲线下面积为0.949(95%CI:0.877～1.021,P<0.05),灵敏度为88.90%,特异度为80.51%。结论 1型糖尿病患儿NK细胞比例及细胞因子水平降低，Th17细胞比例及细胞因子水平升高，可用于疾病预测。

关键词：
1型糖尿病
儿童
儿童糖尿病
自然杀伤细胞
辅助性T细胞17
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1型糖尿病约占儿童糖尿病的80%～90%,年龄较小的患儿更易发生酮症酸中毒，早期使用敏感指标诊断具有重要意义[1,2]。目前认为1型糖尿病发生、进展过程中涉及多种固有免疫细胞间的相互调控，胰岛β细胞减少或损伤与免疫细胞的攻击作用有关[3,4]。本研究选取46例1型糖尿病患儿，分析NK细胞、Th17细胞及其细胞因子在外周血中的表达及临床意义，为临床研究提供参考。

1、对象与方法

1.1 研究对象

选取2021年1月—2022年1月湖州市中心医院收治的1型糖尿病患儿46例作为研究组，健康体检的健康儿童50例作为对照组。研究组中，男22例，女24例；年龄6～15岁，平均(10.34±2.12)岁；体质量指数(18.46±2.56)kg/m2。对照组中，男24例，女26例；年龄7～15岁，平均(10.78±2.34)岁；体质量指数(18.54±2.41)kg/m2。两组资料具有可比性(均P>0.05)。所有研究对象家属均知情本次研究，且经过医学伦理委员会批准。纳入标准：①研究组患儿符合相关指南[5]中1型糖尿病的诊断标准，初次确诊，未治疗；②对照组无血糖升高表现，且无糖尿病家族史，身体健康；③两组均自愿参与研究。排除标准：①存在未纠正的酮症酸中毒；②有重要脏器损害；③非1型糖尿病；④有先天性疾病，如先天性心脏病、先天性免疫缺陷；⑤有癫痫、精神异常者。

1.2 方法

1.2.1 样本采集

取所有入组儿童次日清晨空腹静脉血3支，1支2 ml保存于EDTA-K2抗凝管中，用于测定NK细胞、Th17细胞。1支2 ml分离出外周血单个核细胞，提取总RNA,用于NK细胞因子NKp46、perfprin表达量。1支4 ml放置于真空管内，离心10 min(离心速度3 000 r/min, 离心半径10 cm)后保存于-80 ℃冰箱中，用于Th17细胞因子白细胞介素-17A(IL-17A)、白细胞介素-23(IL-23)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平检测。检测入组儿童的血糖、血脂指标。

1.2.2 NK细胞、Th17细胞检测

取保存于EDTA-K2抗凝管中的样本，使用贝克曼库尔特流式细胞仪测定NK细胞、Th17细胞比例。

1.2.3 NK细胞因子检测

使用实时荧光定量PCR法测定NK细胞因子NKp46、perfprin表达量，取获得的RNA进行逆转录操作，逆转录条件：70 ℃ 10 min, 42 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min。由上海吉玛公司合成NKp46、perfprin基因及内参基因GAPDH引物序列，NKp46上游引物序列：5'-GCAGCAGACTCTCCCAAAAC-3',下游引物序列：5'-CCTGGCAACACATGGTCACTT-3';perfprin上游引物序列：5'-GACTGCCTGACTGTCGAGG-3',下游引物序列：5'-TCCCGGTAGGTTTGGTGGAA-3';GAPDH上游引物序列：5'-TGCGTGAGATTAAGGAGAAG-3',下游引物序列：5'-GCTCGTAGCTCTTCATCCA-3'。预变性(95 ℃ 30 s)、变性(95 ℃ 5 s)、60 ℃退火，延伸31 s, 45个循环，目的基因表达量采用2-ΔΔCt法计算。

1.2.4 Th17细胞因子检测

取离心的血清，使用酶标仪(南京德铁实验设备有限公司)测定Th17细胞因子IL-17A、IL-23、IL-1β水平。

1.3 统计学分析

数据均采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，满足正态分布或近似正态分布的计量资料用

表示，组间比较用两独立样本t检验；计数资料用[例(%)]表示，组间比较用χ2检验；衡量两个变量的相关性采用Pearson相关性分析；使用logistic法进行多因素回归分析；使用受试者工作特征(ROC)曲线分析预测效能。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 两组实验室指标比较

两组糖化血红蛋白、空腹血糖水平及谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)阳性率比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 两组实验室指标比较

2.2 两组NK细胞、Th17细胞比例及细胞因子水平比较

研究组NK细胞比例及NK细胞因子水平均低于对照组，Th17细胞比例及Th17细胞因子水平均高于对照组(均P<0.05)。见表2。

2.3 NK细胞、Th17细胞与1型糖尿病患儿糖化血红蛋白、空腹血糖、GAD-Ab的关系

NK细胞及NK细胞因子与1型糖尿病患儿糖化血红蛋白、空腹血糖、GAD-Ab均呈负相关，Th17细胞及Th17细胞因子与1型糖尿病患儿糖化血红蛋白、空腹血糖、GAD-Ab均呈正相关(均P<0.05)。见表3。

表2 两组NK细胞、Th17细胞比例及细胞因子水平比较

表3 NK细胞、Th17细胞与1型糖尿病患儿糖化血红蛋白、空腹血糖、GAD-Ab的关系(r值)

2.4 NK细胞与Th17细胞的相关性

相关性分析发现：NK细胞与Th17细胞呈负相关(r=-0.785,P<0.05)。见图1。

2.5 儿童1型糖尿病发生的影响因素分析

以儿童1型糖尿病为因变量(发生=1,未发生=0),以糖化血红蛋白，空腹血糖，GAD-Ab, NK细胞，NK细胞因子NKp46、perfprin, Th17细胞，Th17细胞因子IL-17A、IL-23、IL-1β为自变量，进行logistic回归分析，结果显示：糖化血红蛋白，空腹血糖，GAD-Ab, NK细胞，NK细胞因子NKp46、perfprin, Th17细胞，Th17细胞因子IL-17A、IL-23、IL-1β均为影响儿童1型糖尿病发生的因素(均P<0.05)。见表4。

2.6 Th17细胞、NK细胞及其细胞因子对儿童1型糖尿病的预测价值

ROC曲线显示：与NK细胞、Th17细胞及其细胞因子单项检测相比，多项联合检测的预测效能最优，曲线下面积为0.949(95%CI:0.877～1.021,P<0.05),灵敏度为88.90%,特异度为80.51%。见图2。

图1 NK细胞与Th17细胞的相关性

表4 儿童1型糖尿病发生的logistic回归分析

图2 Th17细胞、NK细胞及其细胞因子预测儿童1型糖尿病的ROC曲线

3、讨论

近年来，有关1型糖尿病发生的免疫学研究已经成为广泛关注的热点，部分研究[6,7]显示Th细胞各亚群表达失衡是导致1型糖尿病发生的重要因素，另外NK细胞、B细胞、巨噬细胞等抗原提呈细胞也直接参与疾病的发生。在上述背景下，本研究为分析儿童1型糖尿病发生的免疫机制，将1型糖尿病儿童作为研究对象，为降低患儿疾病相关不良事件和疾病研究提供参考。

部分研究[8,9,10]显示：NK细胞作为重要的诱导因子和调节因子，其含量在1型糖尿病患者中降低。NK细胞在糖尿病患者中不仅具有保护作用，而且具有破坏作用[11,12]。一项报道[13]发现在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠胰岛中分离的NK细胞可产生更多的干扰素-γ,说明存在于糖尿病小鼠胰岛中的NK细胞具有较强的毒性。NK细胞表面分布着抑制性和激活性受体，其中NKp46及perfprin可反映NK细胞活性状态，NOD小鼠实验发现NKp46具有识别胰岛β细胞配体的作用[14,15]。上述研究结论均提示1型糖尿病发生过程中NK细胞及其细胞因子发挥着重要作用。本研究结果显示：NK细胞及其细胞因子NKp46、perfprin水平均降低，提示NK细胞功能异常，导致免疫障碍，最终引起儿童1型糖尿病的发生。

CD4+T细胞和CD8+T细胞介导的β细胞破坏参与1型糖尿病的发生，最近发现Th17与1型糖尿病病理学有关，报道称Th17细胞扩增在1型糖尿病条件下不受约束，某些Treg细胞在1型糖尿病中存在缺陷并失去对Th17扩增的控制[16,17]。此外，抗原提呈细胞的功能改变和在1型糖尿病中自发分泌IL-1β和IL-6的单核细胞亚群也决定了Th17的异常扩增[18]。致病性Th17细胞可导致效应T细胞和调节性T细胞之间的不平衡，从Th17到Th1表型的转换和Th17刺激的细胞毒性T细胞反应也可能在1型糖尿病中发挥辅助作用[19]。报道[20]称，Th17细胞在1型糖尿病中表达升高，且其细胞因子IL-17A含量随之增加，两者可通过促进IL-1β等促炎因子的表达而诱导β细胞凋亡。另有文章指出IL-23受体不存在于初始T细胞中，因此IL-23不参与Th17细胞分化，但Th17细胞功能的稳定性受IL-23表达的影响[21,22]。在1型糖尿病患者中，IL-23含量增加，可引起CD4+T细胞向Th17细胞分化，进而促进Th17细胞相关因子合成分泌，如IL-17A[23]。本研究发现：在1型糖尿病患儿外周血中，Th17细胞及其细胞因子均为高表达，原因可能为Th17细胞异常扩增而导致β细胞凋亡损伤。

本研究显示：NK细胞、Th17细胞呈负相关，提示NK细胞、Th17细胞可能在儿童1型糖尿病的发生、进展中存在一定关联，但本研究仅证实了两者的关系，并未深入分析两者作用的具体机制，还需后续研究在此方面深入探讨，以明确两者之间的关系。

综上，1型糖尿病患儿NK细胞比例及细胞因子水平降低，Th17细胞比例及细胞因子水平升高，可用于疾病预测。

参考文献:

[2]焦丽华,厉红,刘建丽.血浆促肾上腺皮质激素､皮质醇水平与1型糖尿病患儿糖化血红蛋白水平的相关性研究[J].中国儿童保健杂志,2021,29(4):377-380.

[3]祁颜艳,杨涛,顾愹.免疫学标志物在1型糖尿病诊断及预测中的应用[J].中国医师杂志,2022,24(2):190-195.

[4]宋青芳.1型糖尿病免疫损伤机制及脐血治疗新进展[J].国际儿科学杂志,2021,48(2):117-121.

[5]中华医学会儿科学分会内分泌遗传代谢学组,中华儿科杂志编辑委员会.中国儿童1型糖尿病标准化诊断与治疗专家共识(2020版)[J].中华儿科杂志,2020,58(6):447-454.

[6]陈国军,杨中汉,冯娟.1型糖尿病的免疫机制研究进展[J].中国医药导报,2017,14(32):39-42.

[7]于莹莹,张小莉,宋超杰,等.肠道菌群对1型糖尿病肠道通透性及免疫作用机制研究进展[J].微生物学杂志,2019,39(4):115-121.

[8]薛君力,李兰芳,李琳芸,等.NKp44+ NK细胞在1型糖尿病患者外周血中的表达[J].中国现代医学杂志,2019,29(1):40-44.

[9]杨明兰,章晓芳,王莉,等.新诊断1型糖尿病患者外周血自然杀伤细胞的变化特点[J].中华内分泌代谢杂志,2012,28(6):455-459.

[16]王国凤,闫永鑫,尹冬,等.新诊断1型糖尿病患者外周血miR-146a与辅助性T细胞17的相关性研究[J].中国糖尿病杂志,2020,28(8):576-580.