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6-姜烯酚对胃癌细胞的影响及相关作用机制研究

2020-10-14 243 上传者：管理员

摘要：目的观察6-姜烯酚对胃癌BGC-823细胞侵袭及迁移的抑制作用,并探讨其可能的作用机制。方法培养人胃癌BGC-823细胞,加入10、20、50μmol/L浓度的6-姜烯酚,继续培养24h。采用MTS法检测细胞增殖情况,细胞划痕实验检测6-姜烯酚对细胞迁移能力的影响,Transwell小室法检测对细胞侵袭能力的影响。采用Westernblot法检测MMP-2、MMP-9以及E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达。结果MTS检测结果表明,6-姜烯酚对胃癌BGC-823细胞的生长有抑制作用,且抑制作用随药物浓度的增加而增强(P<0.05,P<0.01)。划痕实验结果显示,6-姜烯酚可使胃癌BGC-823细胞的平面运动能力下降。Transwell侵袭小室实验结果显示,6-姜烯酚对胃癌BGC-823细胞体外的侵袭力具有很强的抑制作用。Westernblot结果表明,6-姜烯酚能够抑制BGC-823细胞MMP-2、MMP-9、N-cadherin蛋白的表达,而增加E-cadherin蛋白表达。结论6-姜烯酚能够抑制胃癌BGC-823细胞的增殖并抑制细胞侵袭,其机制可能与影响EMT相关蛋白的表达有关。

关键词：
6-姜烯酚
BGC-823细胞
侵袭
增强
抑制
胃癌
迁移
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胃癌是导致癌症死亡的第3大原因,也是危害人类健康的第3大恶性肿瘤[1,2],我国胃癌发病率为3.128/万人,合计5年相对生存率为27.4%[3]。晚期胃癌通常预后不良,导致临床治疗失败、复发和死亡[2,3]。化疗药物的临床疗效并不理想,且有不良反应。患者在治疗后死亡率仍然很高,5年生存率低于30%[4]。因此,寻找有效、安全的抗癌药物成为研究热点。

生姜的重要成分6-姜烯酚是一种酚醛酮,具有广泛的生物效应,包括抗氧化、抗炎和抗癌活性[5,6,7]。前期研究发现,6-姜烯酚可抑制胃癌BGC-823细胞的增殖[8]。本研究主要对6-姜烯酚对胃癌BGC-823细胞的侵袭及迁移的影响进行探索,在胃癌侵润及迁徙过程中,涉及多种相关的蛋白酶。在近期的研究中,其质金属蛋白酶及钙黏着蛋白(cadherin)受到较多的关注。前者主要是增加癌细胞的侵袭能力,后者主要是抑制癌细胞的侵袭。本研究选择MMP-2、MMP-9及E-cadherin、N-cadherin进行观察,以进一步探究6-姜烯酚对胃癌BGC-823细胞影响的机制。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞

胃癌BGC-823细胞,上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库。

1.1.2药物

6-姜烯酚(纯度为97%),美国Sigma公司(批号:555-66-8);RPMI-1640培养基、细胞裂解缓冲液,碧云天生物技术有限公司;胰酶,美国Gibico公司;基质胶(Matrigel),美国BD公司;兔抗人E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9和β-actin抗体,均购自美国Abcam公司。

1.1.3仪器

倒置生物显微镜,厦门麦克奥迪公司(型号:AE31);酶标仪,美国Bio-Rad公司(型号:Bio-Rad550);蛋白电泳仪及转膜仪,美国Bio-Rad公司(型号:1704150)。

1.2细胞培养

在湿润的培养箱中,将BGC-823细胞与含有10%胎牛血清的RMPI-1640一起孵育,温度为37℃,CO2浓度为5%。胰酶消化后消化细胞,并用缓冲液漂洗2次。当细胞密度达到约80%时,将细胞传代培养24h,然后用6-姜烯酚处理。

1.3分组与干预

实验分0μmol/L组(对照组)和6-姜烯酚干预组(10μmol/L组、20μmol/L组及50μmol/L组),6-姜烯酚以培养液稀释进行干预。

1.4检测指标与方法

1.4.1细胞增殖能力测定

采用MTS测定法测量细胞增殖情况。在96孔板中每孔铺板约1×104个细胞,复孔数为4,培养箱中静置24h,弃去培养液,然后加入含0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L及50μmol/L的6-姜烯酚的培养液继续培养24h。每孔加入20μL新配制的5g/L的MTT,培养箱中避光孵育4h,弃去上清液,每孔再加入150μL的DMSO,振荡10min,用酶标仪在492nm下测量吸光度值。

1.4.2Transwell侵袭小室实验

将基础凝胶(50mg/L)和无血清RPMI-1640培养基按1∶3的比例稀释。然后将100μL稀释的基质胶放置在腔室的上腔室中,并在37℃下保持无菌过夜,以确保基质胶完全聚合。为了进行侵袭测定,收集处于对数生长期的2×108/L细胞,并将200μL含不同浓度的6-姜烯酚细胞悬液添加至每个孔的上室中,并补充300μL的RMPI-1640培养基。在这两次检测中,将500μL含10%FBS的RMPI-1640添加到下部腔室中。然后将细胞在37℃条件下分别侵袭24h、48h。侵入下部腔室的细胞被固定在聚甲醛下,在甲醇中渗透并用结晶紫染色。拍照并计算穿过未覆盖膜的侵袭细胞的数量。最终结果是4个随机选择的段中的平均单元数。

1.4.3细胞划痕实验

取处于对数生长期的细胞,并以2×108/L接种在24孔板中。当细胞汇合至约80%时,以无血清的RMPI-1640替换,并将细胞继续培养24h。当细胞生长到完全汇合时,使用10μL注射器尖端刮擦每个孔的单层细胞。造成划痕后,将细胞用PBS冲洗2次。然后沿着划痕的边缘使用倒置显微镜进行观察并拍照。换不同浓度的6-姜烯酚继续培养24h后,在倒置显微镜下观察刮擦愈合的程度并照相。计算穿越0h的划痕边界的细胞数,并与对照组划痕的细胞数进行比较,算出百分比(反映细胞的细胞迁移能力)。重复上述实验至少3次。

1.4.4E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表达

采用Westernblot法检测上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)标志性蛋白E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表达。6孔板培养BGC-823细胞,以含0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L及50μmol/L6-姜烯酚的培养液培养24h,分别加入SDS裂解缓冲液,收集细胞并在RIPA缓冲液中裂解。通过在4℃下离心(5500r/min)20min来提取全蛋白。将蛋白质转移到PVDF膜上,将其在5%脱脂奶粉中封闭2h。然后在4℃的5%脱脂奶粉中向膜中添加一抗E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9(均1∶1000稀释)过夜。培养24h后,在TBST缓冲液中洗涤膜5次,然后与HRP标记的羊抗兔二抗(1∶10000)在室温下培养2h。再次使用TBST5次后,使用ECL发光,使用ImageProPlus软件分析蛋白水平。并以β-actin蛋白为参照,蛋白的相对表达量计算方法为各蛋白发光强度与β-actin蛋白发光强度的比值。

1.5统计学方法

采用SPSS10.0软件分析实验数据。计量资料以x¯±s表示,采用单因素方差法进行统计学分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.16-姜烯酚对胃癌BGC-823细胞增殖的影响

6-姜烯酚处理24h后,各组细胞的OD值降低,其中10μmol/L及20μmol/L组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),50μmol/L组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),且细胞OD值的降低随6-姜烯酚浓度的增加,降低更明显。见图1。

图1不同浓度的6-姜烯酚对胃癌BGC-823细胞增殖的影响

注:与0μmol/L组比较,*P<0.05,**P<0.01;n=4。

2.2对胃癌BGC-823细胞侵袭能力的影响

6-姜烯酚干预后,BGC-823细胞穿梭实验结果如图2A。其中暗色斑块为迁移至对侧的细胞,可见6-姜烯酚组的迁移细胞数量有所减少,细胞的侵袭能力有所下降。

对细胞穿梭实验各组平均细胞迁移数统计的结果见图2B。与0μmol/L组比较,6-姜烯酚处理后,各组细胞的平均细胞迁移数均降低,其中10μmol/L及20μmol/L组与对照组比较,降低明显(P<0.05),50μmol/L组与对照组比较,降低更明显(P<0.01),且随6-姜烯酚浓度的增加,平均细胞迁移数的降低有增加趋势。

2.3对胃癌BGC-823细胞迁移能力的影响

6-姜烯酚干预BCG-823细胞,划痕实验的结果见图3A。与划痕0h比较,对照组与6-姜烯酚干预组在划痕24h划痕的宽度变窄,其中对照组划痕的宽度几乎消失,6-姜烯酚干预组的划痕宽度比对照组宽,BCG-823细胞在6-姜烯酚干预后,细胞的迁移能力下降。

各组BCG-823细胞在24h划痕与0h划痕宽度的比值统计结果见图3B。10μmol/L、20μmol/L和50μmol/L组的划痕修复至21%、36%和54%,与对照组(9%)比较,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),表明6-姜烯酚能够抑制BCG-823细胞的迁移,且随6-姜烯酚浓度的增加,抑制作用也增加。

图2不同浓度的6-姜烯酚对胃癌细胞侵袭能力的影响

注:A为不同浓度的6-姜烯酚作用24h后,通过Transwell分析检测细胞侵袭;B为平均细胞迁移数。与0μmol/L组比较,*P<0.05,**P<0.01;n=3。

图3不同浓度的6-姜烯酚对胃癌细胞迁移能力的影响

注:A为不同浓度的6-姜烯酚作用24h后,通过划痕实验分析检测细胞迁移;B为伤口愈合比。与0μmol/L组比较,*P<0.05,**P<0.01;n=3。

2.4对EMT相关蛋白的影响

6-姜烯酚处理后,各组BCG-823细胞EMT相关蛋白表达量见图4A。与对照组比较,6-姜烯酚处理后,E-cadherin蛋白的表达增加,而N-cadherin、MMP-2和MMP-9的表达下降,且随6-姜烯酚浓度的增加,蛋白表达的变化也呈增加趋势。

以β-actin蛋白为参照,各组细胞EMT相关蛋白相对表达量计算结果见图4B。可见E-cadherin蛋白的相对表达量增加,与0μmol/L组比较,20μmol/L及50μmol/L组增加显著(P<0.01);而N-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白的相对表达量均下降,与0μmol/L组比较,10μmol/L、20μmol/L及50μmol/L组蛋白的相对表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。

图4不同浓度的6-姜烯酚对胃癌细胞EMT相关蛋白的影响

注:与0μmol/L组比较,*P<0.05,**P<0.01;n=3。

3、讨论

肿瘤转移被认为是大多数癌症患者死亡的主要原因。作为肿瘤发生的最早阶段之一,EMT标志性蛋白是增加癌细胞侵袭和转移能力的重要因素,因此,寻找有效的抑制癌症转移的药物至关重要。

6-姜烯酚作为一种中药提取成分,已有多项研究证明其能够诱导多种肿瘤细胞凋亡,其中包括结肠癌、肝癌、胃癌、前列腺癌和膀胱癌以及黑色素瘤[7,9,10]。在之前的研究中也发现6-姜烯酚以剂量依赖方式降低胃癌细胞BGC-823的活力[7],但未能揭示其是否与癌细胞侵袭能力的改变有关。为进一步明晰6-姜烯酚对胃癌细胞侵袭及迁移能力的影响及机制,课题组首先观察了6-姜烯酚对胃癌BGC-823细胞生存率及侵袭能力的影响。结果显示,和前期研究结果一致[8],6-姜烯酚可显著抑制BGC-823细胞的生长。同时细胞的迁移数量也减少,细胞侵袭能力降低,但细胞生长的抑制与细胞的侵袭能力下降相关程度则需要另外研究。

细胞外基质(extracellularmatrixc,ECM)和基底膜结构屏障的降解和破坏是肿瘤侵袭和转移的一个重要步骤,可为肿瘤细胞的转移创造有利条件[11]。而MMP是ECM分解代谢的关键酶,MMP-2和MMP-9在肿瘤侵袭和转移中起关键作用[12,13]。进一步观察MMP-2及MMP-9在此过程中的变化,发现6-姜烯酚作用BGC-823细胞后,细胞内MMP-2及MMP-9的蛋白表达下降,可见6-姜烯酚抑制BGC-823细胞侵袭与转移可能与抑制MMP-2及MMP-9蛋白表达下调有关。

钙黏着蛋白作为一类Ca2+依赖性半胱氨酸蛋白酶,其生物学功能十分广泛,可参与调控细胞生长周期与凋亡、细胞骨架的形成及蛋白质的更新等。在Cadherin-switch理论中,间质细胞表型转化后是E-cadherin的缺失和N-cadherin的表达,后者是影响肿瘤侵袭和转移的最重要分子[14,15]。为探究6-姜烯酚对胃癌细胞侵袭及迁移的影响与钙黏着蛋白的关系,课题组同时也观察了E-cadherin和N-cadherin的表达。结果显示,6-姜烯酚处理后,BGC-823细胞的E-cadherin的表达增加,而N-cadherin的表达下降,说明6-姜烯酚抑制BGC-823细胞侵袭与转移也可能与E-cadherin、N-cadherin的表达变化有关。

综上,6-姜烯酚可抑制BGC-823细胞的增殖、侵袭和转移,其机制可能与下调MMP-2、MMP-9、N-cadherin蛋白表达,上调E-cadherin蛋白表达有关。当然,其作用的具体机制尚需进一步深入研究。

参考文献:

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基金:国家自然科学基金资助项目(21102055);吉林省科技厅科技发展项目(20190701062GH);吉林省教育厅“十三五”科学技术研究项目(JJKH20191062KJ).