胃癌(gastric cancer, GC)是全球发病率第5位、病死率第4位的消化道恶性肿瘤[1]。胃肠上皮化生(intestinal metaplasia, IM)作为Correa肠型GC癌变模式的关键环节[2]。因此，对IM进行及时而有效的干预是降低早期GC发生率的重要手段。相关Meta分析显示，中医治疗IM在临床疗效结果、胃镜检查结果、黏膜病理检查结果、Hp转阴率等方面均优于目前常规药物疗法[3]。其机制靶点与调节胃黏膜细胞凋亡、保护胃黏膜屏障、抗炎及抑制血管形成等有关[4]。

本研究基于生物信息学筛选IM的关键基因，分析其信号通路及作用机制，研究关键基因在GC中的表达与预后情况，预测潜在靶向中药，旨在为IM及早期GC的诊断及预防提供新的思路。

1、资料与方法

1.1 基因芯片的选取以及差异基因的筛选

本研究从GEO数据库样本中以“intestinal metaplasia”为关键词检索，筛选条件：(1)“Expression profiling by arry”;(2)“Homo sapien”;(3)该样本的系列中含有正常对照的系列；(4)数据详细，包括Gene Symbol等信息。最终筛选得到GSE78523(包括15个正常组织和16个未进展为GC的IM组织样本)与GSE60427(包括8个正常组织和8个IM组织样本)作为本次研究分析的对象。通过GEO2R分析，设定筛选条件P<0.05,log2FC绝对值>1,分别得到不同芯片的差异基因，并通过R软件ggplot2与Venn Diagram包得到芯片间共同表达的差异基因。

1.2 差异基因生物学功能及通路分析

将共同差异基因进行ID转换后，运用R语言中的“clusterProfiler”包[5]进行基因本体(Gene Ontology, GO)功能富集分析、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes, KEGG)通路富集分析，包括生物过程(biological process, BP)、细胞组分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络构建及关键基因的识别

将差异基因上传到STRING数据库,选择互作评分为高置信度(0.400),构建PPI,在Cytoscape(Version 3.9.1)软件中进行可视化。使用CytoHubba插件中的MCC、Degree、EPC及MNC算法分别获取评分前15名的基因，通过韦恩图筛选共有的基因作为关键基因。

1.4 PLGC关键基因生存分析及表达验证

利用Kaplan-Meier Plotter数据库对关键基因进行总生存率(overall survival, OS)分析。在GEPIA数据库中依次导入关键基因，验证其在GC与正常组织间的表达水平差异。将筛选出的关键基因输入HPA数据库,分别选择Tissue和Pathology模块，在Tissue中选择Stomach, 在Pathology模块中选择Stomach cancer, 分析比较正常组织和癌症组织中关键基因在蛋白水平的表达差异。

1.5 潜在有效中药的筛选预测

在Coremine Medical数据库中依次导入关键基因，以P<0.05为差异有统计学意义进行中药筛选。

2、结果

2.1 IM的差异表达基因

通过使用GEO2R在线工具分析微阵列数据集，本研究从GSE78523获得了600个差异表达基因，包括172个上调基因和428个下调基因，从GSE60427获得了2 711个差异表达基因，包括925个上调基因和1 786个下调基因，绘制韦恩图，最终获得285个共同差异表达基因，见图1。

2.2 GO功能、KEGG通路富集分析

将285个差异基因的GO功能富集分析包括BP、CC、MF 3部分。以P<0.05筛选并选取P值最小的前10位结果进行可视化，见图2。BP主要富集于消化肠道吸收、消化系统过程、激素水平的调节、肠道脂质吸收的调节、肠道脂质吸收、膜间脂质转运、信号受体配体前体处理、有机阴离子转运、肠道吸收的调节等；CC主要富集于细胞的顶端部分、顶端质膜、刷状缘、基于肌动蛋白的细胞投影簇、刷状缘膜、高尔基体腔、细胞突起膜、微绒毛、基底外侧质膜、内质网腔等；MF主要富集于胆固醇转移活性，甾醇转移活性，脂质转移活性，甾醇转运蛋白活性、溶质：钠转运体活性、谷氨酸结合、脂质转运蛋白活性、羧酸结合、二级活性跨膜转运体活性、内肽酶活性等；KEGG主要富集于营养物质的消化和吸收、糖酵解/糖异生、胆汁分泌、果糖和甘露糖的代谢、胆固醇代谢、精氨酸的生物合成、肾素-血管紧张素系统、近端肾小管碳酸氢盐回收等。

图1 差异基因的筛选   

图2 DEGs的GO功能、KEGG通路富集分析结果  

2.3 PPI网络分析及关键基因的筛选

根据STRING数据库构建273个节点基因及557条边数的PPI网络，见图3。利用CytoHubba插件的MCC、Degree、EPC及MNC算法分别获取评分前15位的基因，最后通过韦恩图分析筛选出7个关键基因，即APOB、FABP1、APOA1、APOA4、NR1H4、PCK1、ALDOB,见图4。

2.4 关键基因对GC的预后分析

将筛选出的7个关键基因进行GC生存分析，其中APOB、APOA1、APOA4、NR1H4高表达组的GC患者的OS均低于低表达组(P<0.05)。FABP1、ALDOB高表达组OS高于低表达组，差异具有统计学意义(P<0.05),见图5。

图3 差异基因PPI   

图4 关键基因的筛选   

图5 核心差异基因与生存分析  

GEPIA数据库结果显示，除APOA1在GC组织中低表达，其余6个DEGs在GC组织中高表达，ALDOB表达差异不显著，见图6。

HPA分析结果显示，GC组织中APOB、FABP1、APOA4、PCK1的蛋白表达量均高于正常组织，与mRNA表达结果一致。GC组织ALDOB的蛋白表达量低于正常组织，差异无统计学意义(P>0.05),与GEPIA数据库分析结果不一致，可能是由数据库样本异质性所致。APOA1在正常组织和异常组织中均未检测到，NR1H4缺乏相关数据，见图7。

2.5 靶向中药的预测分析

通过Coremine Medical数据库对IM核心基因靶向的中药进行梳理，基因与药物的对应关系见表1。

图6 基因mRNA表达水平验证(红色为肿瘤组织，灰色为正常组织)  

图7 关键基因在GC组织和正常组织中的表达  

表1 中药预测结果

3、讨论

IM指正常胃黏膜上皮细胞被肠型上皮细胞取代，出现吸收细胞、杯状细胞、帕内特细胞等肠道特异性细胞，常伴发于CAG,是诱发GC的重要因素[6]。

3.1 IM与糖代谢、脂质代谢异常、胆汁反流密切相关

基于GEO数据库对正常组织和IM组织进行差异基因筛选，对其GO通路富集分析发现，差异表达基因生物功能差异主要表现在消化系统的吸收调节功能、肠道及膜间脂质的吸收、物质转运及活性等方面。KEGG信号通路富集分析结果显示，IM过程与营养物质的消化和吸收、糖酵解/糖异生、胆汁分泌、胆固醇代谢密切相关。其中，有氧糖酵解被称为瓦博格效应，是癌细胞中常见的代谢重编程之一，指在氧气不受限制的情况下，大多数癌细胞表现出高葡萄糖摄取率，葡萄糖衍生的丙酮酸远离线粒体不进行氧化磷酸化而发生糖酵解，代谢产物乳酸高，可为肿瘤组织提供大量碳源[7]。研究表明，中药有效成分能通过调控糖酵解逆转胃癌前病变的过程[8]。胆汁由肝细胞产生，由胆盐、胆色素、胆固醇、卵磷脂、钾、钠、钙等组成，可乳化脂肪，参与脂肪和脂溶性维生素的消化吸收，利胆和中和胃酸。在某些情况下，十二指肠内容物，包括胆汁、胰液、十二指肠液等逆行向上反流到胃内即胆汁反流。研究表明，胆汁反流与上消化道炎症、糜烂、IM和癌的发生密切相关，胆汁反流引起的胃黏膜慢性炎症是胃黏膜IM的关键致病因素[9],表明本研究对IM发病机制的生物信息学分析结果可靠。

3.2 IM关键基因是防治GC的潜在靶点

通过PPI网络和Cytohubba软件筛选IM的7个关键基因：APOB、FABP1、APOA1、APOA4、NR1H4、PCK1、ALDOB。APOB、APOA1与APOA4均属于载脂蛋白家族，在脂肪消化吸收(hsa04975)和维生素消化吸收(hsa04977)两种途径中均富集[10]。APOB是低密度脂蛋白胆固醇的主要结构蛋白，而APOA1与APOA4是高密度脂蛋白的主要成分。近年来，载脂蛋白与癌症的关系研究更加深入，癌细胞最重要的代谢特征之一是脂质代谢失调，脂质可为癌细胞提供能量、膜合成所需的底物和信号分子[11]。已有研究证明，APOB/ APOA1可作为GC的独立预后标志物，比值高的GC患者生存率低[12]。APOB的高表达与非小细胞肺癌、结肠癌、胆囊癌等多种癌症的发生及预后密切相关[13,14,15]。而APOA1的表达与GC的生长、浸润深度、淋巴结分期及分型呈负相关[16]。研究发现，APOA1可抑制肿瘤的血管生成及生长[17],GC组血清APOA1和高密度脂蛋白水平均显著低于正常组[18]。目前，关于APOA4的报道较少，本研究中APOA4作为IM的关键基因在GC组织中高表达，现有研究主要联合其他载脂蛋白分析其在GC中的表达[10]。

AC115619.1-APOA4/APOB和AP006216.2-APOA1/APOA4整合可能通过调控脂肪和维生素消化吸收在GC中发挥作用。FABP1结合转运长链脂肪酸分子，参与糖代谢与脂质代谢[19]。高脂饮食会增加肝脏和肠道中FABP1的水平，导致代谢紊乱，在肝癌、结直肠癌、胰腺癌等癌症患者中发现血清FABP1水平升高，脂质代谢异常[20,21,22]。研究发现，FABP1在胃黏膜IM组织中呈表达最高，在胃腺癌组织中表达较低，而在正常组织中无表达或表达较少[23],与本研究结果基本一致。NR1H4又名FXR,是胆汁酸最关键的受体，FXR参与胆汁酸诱导IM的发生发展，胆汁酸可通过激活FXR/NF-κB信号通路上调CDX2的表达[24]。研究表明，GC组织中FXR的表达高于正常组织和慢性胃炎组织，与IM组织相比，显著降低，FXR随着IM程度的加重而表达增加，随着GC分化程度的降低而表达下降，与CDX2表达一致[25,26]。PCK1是调节糖异生的限速酶[27],在胃正常组织中低表达，在GC组织中高表达[28],可通过诱导AKT-mTOR信号通路的活化调控GC细胞的生长、增殖和迁移。沉默或过表达会抑制或增强EMT及MAPK/ERK通路与GC的淋巴结转移、腹膜转移相关[29]。ALDOB是果糖代谢中的关键酶之一，参与了糖酵解与糖异生通路。ALDOB在GC组织中的表达低于癌旁非癌组织的表达，与肿瘤的局部浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期相关，是影响GC患者生存预后的一个独立影响因素[30]。综上，现有研究表明，以上7个IM的核心差异基因与GC的发生发展均有一定联系，主要涉及脂质代谢、糖异生、糖酵解、胆汁酸合成与转运、维生素代谢等途径，与本研究富集分析结果相符，可将筛选出的关键基因作为干预IM及防治GC的靶点进一步研究。

3.3 靶向预测的中药是防治GC的潜在药物

IM是现代医学概念，无特定的中医学病名，根据患者临床症状可将其归于中医学“胃痞”“胃痛”“嘈杂”等范畴[31]。IM作为PLGC的重要阶段，病机以脾虚为本，瘀毒为标[32]。GC多因外感邪气、饮食失调、情志内伤、劳倦过度，耗伤脾胃，中焦运化无力，气机升降失调，气血瘀滞，邪浊不化，湿热内蕴，瘀热胶结成毒，久则胃络受损，浊毒内壅成形，导致胃膜萎缩化生恶变。“健脾通络解毒”可作为治疗该病的基本治则[33]。本研究分析出的关键基因所靶向预测的中药功效与上述中医理论不谋而合。

基于IM关键基因预测到的健脾益气和胃类药包括白术、石斛、山柰、绞股蓝、芡实等。其中白术补气健脾燥湿，可显著缓解肿瘤炎症微环境，抑制GC细胞侵袭和增殖[34];铁皮石斛益胃生津，实验证明其具有诱导细胞凋亡，抑制GC癌变之效[35];山柰温中行气除湿，其中甲氧基肉桂酸乙酯是抗促癌有效成分[36];绞股蓝益气健脾，芡实补脾益肾，均能诱导细胞凋亡及抑制GC细胞增殖[37,38]。而紫苏子、木香、山楂、薤白等药物发挥补中求通、消补结合、调畅气机之效，防补益壅滞中焦。紫苏子行气宽中，其亚麻酸成分可根除幽门螺杆菌，抑制上皮间质转化[39];木香行气温中和胃，去氢木香内酯可促进细胞内ROS产生，破坏线粒体膜结构，诱导细胞自噬性死亡和凋亡，抑制GC细胞增殖[40,41];山楂健胃消食行气，山楂多糖可发挥抑制GC细胞AGS增殖的作用[42];薤白行气导滞，挥发油可增加GC细胞内P53蛋白表达抑制GC细胞生长[43]。

针对胃络瘀阻的祛瘀通络类药物以红花、当归、仙人掌、肿节风等药物为代表。《中药药理学》中明确指出红花具有抗肿瘤的作用，红花多糖具有抑制肿瘤细胞增殖、侵袭与转移、免疫调节、抗凝血等多种药效作用[44];当归多糖能够靶向肿瘤微环境，提高免疫细胞和免疫因子的活性，达到间接抗肿瘤的目的[45];仙人掌可行气活血凉血，对人胃腺癌、大肠癌细胞生长的抑制作用[46];肿节风可祛风活血，使GC细胞在S期、G2/M期发生阻滞，抑制GC生长[47]。

黄连、大黄、野菊花、马齿苋等清热解毒类药物可祛邪解毒消积，防治PLGC,抑制浊毒内壅。黄连主要通过槲皮素、巴马汀、表小檗碱、甲基黄连碱等有效化学成分，可调控DNA结合转录因子结合、细胞因子受体结合、泛素样蛋白连接酶结合、激酶调控因子活性等生物过程治疗GC[48];大黄中提取芦荟大黄素抑制细胞基质的形成，抑制GC细胞侵袭、转移[49];野菊花中药效成分黄酮类化合物具有抗病原微生物、消炎、抗氧化、保肝的作用，可抑制乳腺癌细胞、骨肉瘤细胞等肿瘤细胞[50,51];马齿苋多糖被实验证明可抑制GC细胞增殖并诱导其凋亡[52]。此外，应用白花蛇舌草、蛇床子、三白草等解毒抗癌药物可加强祛邪解毒之效。研究表明，白花蛇舌草、蛇床子能诱导GC细胞凋亡，发挥其抗肿瘤活性[53,54]。三白草酮通过抑制TGF-β1诱导的GC细胞上皮间质转化[55]。以上差异基因靶向中药与健脾通络解毒的治法相符，有望成为治疗IM的潜在药物，抑制GC的进展。

综上，本研究利用生物信息学分析IM核心差异基因，为防治GC提供靶向中药，对后续药物研究提供新思路。本研究数据库基因样本数有限，未对IM分型，需进一步扩大样本量，细分肠化类型；中医药治疗强调整体观与辨证论治，本研究根据基因靶向分析单味中药作用较局限，对中药复方及药物间的相互作用关系还不清楚，有待于进一步实验及临床研究验证当前结论。

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基金资助:国家自然科学基金资助项目(82174352);首都卫生发展科研专项资助项目(首发2020-2-4152); 中国中医科学院广安门医院国家中医临床研究示范基地科研专项暨所级科研基金资助项目(2019S445);

文章来源:易柳凤,陶思羽,李萌,等.基于生物信息学分析胃肠上皮化生关键基因及靶向中药[J].中医学报,2024,39(05):1082-1090.