胃癌是常见的消化道肿瘤，其发生发展受多种因素的影响，包括环境因素和遗传因素[1]。依据其解剖部位和组织病理学类型进行分类，临床上近96%的胃癌病理类型为腺癌。胃癌被确诊时常为晚期，患者预后较差。目前，对大多数胃癌患者的治疗方式以手术治疗为主，而在非手术治疗方面，全身治疗可改善晚期或发生局部转移的胃癌患者的生存率，并提高其生活质量[2]。目前，多数化疗药物的作用机制是通过诱导胃癌细胞发生凋亡以抑制胃癌的生长，但肿瘤细胞也可能出现“癌基因成瘾”现象，使胃癌细胞对化疗药物产生耐药性，从而导致治疗失败。因此，有必要探索新的诱导非凋亡形式的细胞死亡途径，以抑制胃癌细胞的进展及改善胃癌的预后。

焦亡是一种炎症性程序性细胞死亡途径，通常由微生物感染引起[3],其特点是细胞膜迅速破裂及释放促炎细胞内容物。研究发现，核苷酸结合结构域样受体(NOD like receptor, NLR)家族pyrin域蛋白3 (NLRP3)激活炎性小体，可引发细胞焦亡[4,5]。NLRP3炎性小体的组装引起Caspase-1裂解激活，从而切割gasdermin D (GSDMD)蛋白，将其分裂成C端和有活性的N端[6],而后者将自组装于细胞膜上形成孔洞，使细胞内外渗透压平衡被破坏，导致细胞内容物释放到细胞外。在此过程中活化的Caspase-1会促进包括IL-1β、IL-18在内的促炎性细胞因子的成熟，并将后者通过孔洞释放到细胞外引发进一步细胞焦亡进程[7]。焦亡具有肿瘤抑制功能，可增强局部和全身抗肿瘤免疫能力[8,9]。因此，寻找安全有效、可转化为临床应用的焦亡激活剂具有重要意义。

纳米粒子(nanoparticles, NPs)通常在多功能、多模态成像和药物递送载体中发挥重要作用[10]。在最近10年中，NPs已成为设计新治疗策略的候选方法[11]。肿瘤纳米治疗药物与传统抗癌药物相比，纳米材料在生物非特异性分布、溶解度、生物利用度方面具有明显的优势[12]。透明质酸钠修饰过氧化钙纳米颗粒(sodium-hyaluronate-modified calcium oxide nanoparticles, SH-CaO2 NPs)触发的程序性细胞焦亡在动物体内外都增强了抗癌药物的疗效，并能有效抑制胃癌的生长和转移[13]。本研究通过观察SH-CaO2 NPs的合成情况及其对胃癌细胞活性、细胞内焦亡相关蛋白表达的影响，探讨SH-CaO2 NPs诱导胃癌细胞发生焦亡的机制，以期为寻找安全有效的可用于胃癌治疗的纳米药物提供理论基础。

1、材料与方法

1.1 SH-CaO2 NPs的制备

制备前，取0.50 mg/mL透明质酸钠水溶液和2 mol/L(0.22 g/mL)氯化钙水溶液作为储备液。将1 mL的透明质酸钠和1 mL的氯化钙依次加入到60 mL的经强力搅拌的无水甲醇中。上述溶液搅拌均匀后，加入1 mol/L的氨水1.11 mL,再次搅拌均匀后，将1.11 mL 30%的双氧水滴入(搅拌速度500 r/min, 滴加速度0.25 mL/min)。当颜色变成剑桥蓝时，将混合物离心，用乙醇洗涤2次，最后分散在去离子水中。

1.2 SH-CaO2 NPs的表征

利用场发射透射电子显微镜(JEM-2100F,200 kV)获得透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)图像。采用Rigaku D/MAX-2250V衍射仪获得X射线衍射(X-ray diffraction, XRD)图谱。利用Bruker张量Ⅱ型红外光谱仪获得傅里叶变换红外光谱(Fourier-transform infrared spectroscopy, FT-IR)。使用Zetasizer Nano S90(英国马尔文公司)获得Zeta电位信息。CCK-8检测用SparkTM多模式酶标仪进行。

1.3 细胞和试剂

人胃癌细胞株HGC-27购自无锡菩禾生物公司；胎牛血清(FBS)、RPMI 1640 培养液、胰蛋白酶购自英国Gibico公司；多聚甲醛购自上海碧云天公司；RIPA裂解缓冲液、BCA蛋白定量试剂盒购自北京索莱宝公司；SDS-PAGE 凝胶电泳试剂盒购自上海雅酶公司；PVDF 膜购自美国Invitrogen公司；青/链霉素/庆大霉素、快速封闭液购自武汉塞维尔公司；NLRP3、Caspase 1/P20/P10 Antibody、GSDMD 购自武汉三鹰公司；羊抗兔IgG H+L (HRP)、羊抗鼠IgG H+L(HRP)、CY3标记的抗兔IgG购自北京博士德公司；增强型化学发光试剂(ECL)购自陕西白鲨公司；氯化钙、透明质酸钠、无水甲醇、无水乙醇、氨水、过氧化氢购自上海麦克林公司；NAC、VX765购自美国MedChemExpress公司；MCC950购自美国Selleck公司；2,7-二氯荧光素二醋酸酯(DCFH-DA)购自江苏凯基生物公司；Hoechest33342购自上海碧云天公司。

1.4 细胞培养

从-80 ℃恒温冰箱中取出装有HGC-27细胞的冻存管，迅速投入37 ℃恒温水浴箱中解冻。将含有10%FBS、1%青/链霉素/庆大霉素的RPMI1640培养液1 mL加入冻存细胞液中，1 500 r/min离心5 min, 去除上清液，再用培养液混匀细胞后转移至细胞培养瓶中，放置在37 ℃恒温，5%CO2的培养箱中培养。

1.5 细胞划痕实验

将HGC-27细胞常规消化后，以1×106个/孔铺到6孔板内，过夜培养至细胞基本融合。用10 μL微量移液头在6孔板内进行划痕，PBS冲洗3次后，加入无血清培养基继续培养，用倒置显微镜于0、24 h分别在同一观察位置进行拍照，采用Image J软件进行测量分析，计算细胞迁移率。公式如下：细胞迁移率(%) = (0 h 划痕面积-24 h 划痕面积) / 0 h划痕面积×100%。

1.6 细胞毒性检测

将HGC-27细胞以2 000个/孔接种于96孔板中，在37 ℃下孵育过夜。细胞贴壁后，用含不同浓度SH-CaO2 NPs(0、10、20、40、80、160 μg/mL)的完全培养基培养24 h, 加入10 μL的CCK-8溶液处理1.5 h。随后测量每孔的光密度值[D(450)],获得细胞存活率。采用80 μg/mL的SH-CaO2 NPs浓度培养不同时间(0、12、24、48、72 h)后，测定胃癌细胞存活率。检测使用ROS抑制剂(NAC)、NLRP3抑制剂(MCC950)、Caspase-1抑制剂(VX765)预处理的胃癌细胞与SH-CaO2 NPs共孵育后的细胞活力，分为空白(NC)组、抑制剂组、SH-CaO2 NPs组及SH-CaO2 NPs+抑制剂组。

1.7 活性氧检测

用荧光探针DCFH-DA检测过量活性氧的产生。将HGC-27细胞接种到玻璃底细胞培养皿的20 mm孔中，将其分为3组，即NC组(完全培养基RPMI1640)、SH-CaO2 NPs组(80 μg/mL,分散在RPMI1640中)以及SH-CaO2 NPs+NAC组(SH-CaO2 NPs 80 μg/mL,NAC 10 mmol/L),在37 ℃下孵育24 h。去除培养基后，用PBS洗涤细胞2次，并向其中加入300 μL的DCFH-DA(10 μmol/L)。在黑暗中共孵育30 min后，取出探针并冲洗掉；然后在甲醇固定细胞前进行细胞核染色，用共聚焦激光扫描显微镜成像(confocal laser scanning microscope, CLSM)观察产生的活性氧，并用流式细胞仪检测细胞内活性氧含量。

1.8 Western blot检测

用RIPA缓冲液裂解提取总蛋白，用BCA蛋白法测定浓度。用TBST稀释相关抗体，NLRP3 (1∶4 000)、Caspase-1/P20/P10 Antibody (1∶4 000)、GSDMD (1∶4 000)。用5%的脱脂牛奶封住聚偏氟乙烯(PVDF)膜后，将其孵育过夜以检测蛋白质。然后与相应的酶标山羊抗兔在室温下孵育1 h。TBST洗净后用ECL检测试剂检测蛋白条带，用Tanon-5200系统(北京原平好生物技术有限公司)拍照。

1.9 免疫荧光实验

对人胃癌细胞进行共聚焦成像，将细胞以13×105个/孔接种在24孔玻璃底板中。予以NAC、MCC950、VX765预处理细胞，并在实验组中加入SH-CaO2 NPs处理，将细胞用PBS洗涤2次，用冷的4%多聚甲醛200 μL固定30 min, 使用2%BSA中的0.1%Triton X-100透化10 min, 在室温下用5%BSA封闭1 h, 然后与1∶100稀释的一抗在4 ℃下孵育过夜，使用CY3标记的抗兔IgG二抗孵育1 h。滴加Hoechest33342复染细胞核10 min后，用PBS洗4次，每次5 min。随后在CLSM上获取细胞图像。

1.10 统计学分析

使用GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析。计量资料进行正态性检验，数据以x¯±s

表示，组间比较采用独立样本t检验和单因素方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 SH-CaO2 NPs的构建与鉴定

在甲醇-水体系中，采用湿化学方法，室温下制备透明质酸钠修饰过氧化钙纳米粒子。TEM图像显示，得到的NPs具有良好的结晶度(图1A),在制备过程中可通过改变混合物的碱度来调节纳米粒子的粒径大小及分散度。XRD表征证实，所得产物的衍射峰与四方CaO2标准卡(PDF#03-0865)的衍射峰一致(图1B),予以红外光谱检测进一步验证，表明CaO2 NPs成功形成(图1C)。进一步使用Zeta电位检测，发现透明质酸钠处理后Zeta电位下降约7 mV(P<0.01,图1D),表明透明质酸钠对过氧化钙纳米粒子成功改性。

2.2 SH-CaO2 NPs抑制胃癌细胞增殖活性

CCK-8法检测在不同浓度的SH-CaO2 NPs作用下HGC-27细胞存活率的变化。予以药物作用24 h, 随着SH-CaO2 NPs浓度的增加，HGC-27细胞的存活率明显降低(P<0.001,图1E)。结合细胞死亡率数据，选用80 μmol/L作为后续SH-CaO2 NPs的实验浓度。并以此浓度进行时间梯度细胞活性检测，提示随着时间的增加胃癌细胞活性逐渐减弱(P<0.001,图1F)。细胞划痕实验结果显示，与NC组比较，使用最适浓度的SH-CaO2 NPs干预后，HGC-27细胞的生长和迁移出现延迟(图1G、H)。

图1 SH-CaO2NPs的一般特性以及其抑制胃癌细胞增殖活性的能力()   

2.3 SH-CaO2 NPs增加胃癌细胞内ROS含量，诱导细胞焦亡并被NAC抑制

采用DCFH-DA荧光探针检测SH-CaO2 NPs(80 μg/mL)作用24 h后细胞内的ROS水平，可见胃癌细胞内的ROS水平显著增加(P<0.001,图2A、B)。使用NAC 10 mmol/L预处理1 h后加入SH-CaO2 NPs (80 μg/mL)作用24 h, DCFH-DA荧光探针检测实验(P<0.001,图2C、D)以及流式细胞仪检测(P<0.001,图3B、C)表明，与SH-CaO2 NPs 比较，NAC预处理能有效抑制SH-CaO2 NPs诱导的细胞内ROS上调。随后运用CCK-8法验证，与单独加入SH-CaO2 NPs相比，使用NAC预处理减少了细胞的死亡率(P<0.001,图3A)。进一步验证了SH-CaO2 NPs诱导的细胞内ROS上调是诱导胃癌细胞发生焦亡的重要原因。Western blot检测结果显示，与SH-CaO2 NPs组比较，NAC预处理显著抑制SH-CaO2 NPs诱导的细胞内NLRP3含量增加以及Caspase-1、GSDMD的激活(P<0.001,图3D、E)。上述结果表明SH-CaO2 NPs诱导的细胞内ROS形成及积聚是进一步激活NLRP3、促使炎症小体形成、引起胃癌细胞焦亡的关键因素。

图2 SH-CaO2NPs对HGC-27细胞内ROS含量以及焦亡通路蛋白含量的影响(n=3,)  

图3 SH-CaO2NPs对HGC-27细胞内ROS含量以及焦亡通路蛋白含量的影响(n=3,)   

2.4 SH-CaO2 NPs通过NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路诱导胃癌细胞焦亡

使用NLRP3的特异性抑制剂MCC950(10 μmol/L)进行预处理，然后加入SH-CaO2 NPs作用24 h。CCK-8法检测结果显示，使用MCC950预处理后胃癌细胞死亡率降低(P<0.001,图4A)。Western blot检测结果显示MCC950成功抑制SH-CaO2 NPs诱导的NLRP3上调以及下游焦亡通路的激活(图4B、C)。免疫荧光观测结果显示，SH-CaO2 NPs处理后细胞内NLRP3荧光表达量显著增加，而此现象会被MCC950抑制(P<0.001,图4D、E)。结果证实SH-CaO2 NPs可以通过增加NLRP3的含量以激活炎性小体诱导胃癌细胞发生细胞焦亡。

使用Caspase-1的特异性抑制剂VX765(10 μmol/L)提前1 h预处理胃癌细胞，随后加入SH-CaO2 NPs (80 μg/mL)继续作用24 h。CCK-8法检测结果显示，使用VX765预处理1 h降低SH-CaO2 NPs诱导的HGC-27细胞的死亡率(P<0.001,图5A)。Western blot检测结果显示，VX765能抑制SH-CaO2 NPs在细胞中引发的Caspase-1、GSDMD剪切体即活性片段表达量的上升(图5B、C)。免疫荧光观测结果显示，SH-CaO2 NPs处理后细胞内Caspase-1的荧光表达量明显增加，而在此基础上使用VX765后观察到Caspase-1荧光表达量减少(P<0.001,图5D、E)。以上结果表明，Caspase-1的激活可能在SH-CaO2 NPs引起的胃癌细胞焦亡中发挥重要的作用。

以上结果证实，SH-CaO2 NPs作用人胃癌细胞后GSDMD的含量增加，且当使用GSDMD上游蛋白NLRP3、Caspase-1特异性抑制剂MCC950、VX765预处理后可逆转此过程。以此说明GSDMD在焦亡中的有重要作用。进一步验证了SH-CaO2 NPs是通过诱导胃癌细胞内ROS/NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路的激活介导肿瘤炎症反应和细胞焦亡的发生。

图4 SH-CaO2NPs处理后对焦亡经典通路中NLRP3的影响

图5 SH-CaO2NPs处理后对焦亡通路中Caspase-1的影响(n=3,)

3、讨论

胃癌是目前临床上常见的消化道恶性肿瘤，已成为世界癌症相关死亡的第3大原因，严重威胁着公众健康[14]。虽然胃癌的诊断和治疗已经取得了很大的成就，且目前绝大多数早期胃癌可通过手术以及术后新辅助化疗达到治愈水平。然而，随着晚期胃癌患者逐渐年轻化、肿瘤耐药性不断提高，频繁出现的放化疗等辅助治疗耐受问题在很大程度上限制了胃癌的临床治疗效果，导致其总生存率仍然很低[15]。因此，迫切需要阐明和加深研究胃癌的潜在发展机制，并开发更多的治疗靶点，而纳米粒子是改善当前胃癌预后和治疗选择的一种潜在策略[16]。焦亡是一种细胞程序性死亡的促炎方式，其特征是形成孔隙、细胞肿胀伴有大气泡，并快速释放肿瘤特异性抗原，在体内已被证明具有高效的抗肿瘤免疫功能。因此，为了克服传统微分子焦亡药物的耐药性和严重的副作用，开发更先进的纳米药物以强力诱导焦亡是必要的。在已被报道的纳米平台上，纳米粒子通过释放相关离子及过氧化物来实现焦亡诱导，导致离子突然激增，细胞内活性氧含量显著升高，从而激活Caspase-1/GSDMD依赖的焦亡途径[17]。本研究发现，SH-CaO2 NPs可通过ROS/NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路诱导胃癌发生细胞焦亡，影响肿瘤进展。

许多纳米粒子在肿瘤的治疗方面展现出良好的效果，其主要的作用机制是氧化应激、细胞毒性和炎症[18]。SH-CaO2 NPs是使用室温快速湿化学法合成的纳米材料，在抑制乳腺癌、胃肠癌进展的机制研究中均显现出较好的抗肿瘤作用。利用pH敏感性的SH-CaO2 NPs进行抗肿瘤治疗是一种高效策略。SH-CaO2 NPs在肿瘤缺氧酸性微环境中会缓慢分解产生H2O2[19],导致细胞内氧化应激的发生，同时过氧化氢酶在胃癌中含量降低[20],氧化应激的持续作用将导致胃癌细胞内活性氧不可控的积累。这些NPs在肿瘤细胞中触发细胞毒性ROS的产生，最终诱导胃癌细胞焦亡[21]。值得注意的是，NPs的杀伤作用对正常细胞的不良影响较肿瘤细胞更小[22]。本研究通过体外实验，证实SH-CaO2 NPs通过激活ROS/NLRP3/Caspase-1/GSDMD依赖的经典焦亡途径诱导胃癌细胞死亡。为验证SH-CaO2 NPs诱导胃癌细胞发生焦亡与细胞内ROS的聚集是否存在联系，本研究检测了SH-CaO2 NPs作用的胃癌细胞中ROS的含量，发现药物作用后细胞内的ROS水平显著升高。而使用ROS抑制剂NAC进行预处理，运用ROS荧光检测及流式细胞分析结果显示，与单纯加入SH-CaO2 NPs的细胞相比，经过NAC预处理的细胞中SH-CaO2 NPs含量明显下降，且CCK-8实验结果提示，NAC预处理后细胞死亡率也随之降低。ROS的产生被普遍认为是NLRP3炎症小体激活的上游机制[23],本研究通过Western blot结果进一步验证，NAC预处理可抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD依赖的细胞焦亡的激活。表明SH-CaO2 NPs可促进胃癌细胞内产生ROS并使其过多聚集，从而诱导胃癌细胞发生焦亡。为验证SH-CaO2 NPs是否会对细胞焦亡通路中的各项蛋白(NLRP3、Caspase-1、GSDMD)产生影响，本研究运用抑制剂分别抑制NLRP3及Caspase-1,通过免疫荧光实验发现，SH-CaO2 NPs能显著增加胃癌细胞内NLRP3以及Caspase-1蛋白的含量，而此过程可被相应抑制剂逆转。进一步运用Western blot实验验证可得到相同结果，CCK-8实验也证明使用抑制剂进行预处理能有效减少SH-CaO2 NPs诱导的细胞死亡。进一步表明SH-CaO2 NPs影响胃癌进展的机制是通过诱导胃癌细胞激活焦亡经典通路，即ROS/NLRP3/Caspase-1/GSDMD,引起胃癌细胞焦亡。

综上所述，SH-CaO2 NPs可以刺激ROS生成，激活NLRP3炎症小体，最终导致胃癌细胞焦亡。因此，靶向ROS/NLRP3/Caspase-1/GSDMD依赖性焦亡可能是一种影响胃癌细胞发生发展的有效途径。这将有利于SH-CaO2 NPs诱导的胃癌细胞焦亡进展进行安全性评估，并为纳米粒子的生物安全性研究提供一定理论基础。

参考文献:

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[9]付宇蕾,罗业浩,方刚,等.细胞焦亡在胃癌中的生物学作用研究进展[J].中国肿瘤临床,2022,49(6):314-318.

[12]唐倩云,杜凌,刘培峰.纳米粒子介导的胃癌诊断与治疗[J].肿瘤,2022,42(7):518-524.

基金资助:镇江市科技创新资金项目(SH2023004)~~;

文章来源:田仪督,高生宝,贡克文,等.透明质酸钠修饰过氧化钙纳米粒子诱导胃癌细胞焦亡[J].陆军军医大学学报,2024,46(13):1535-1544.