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青砖茶提取物缓解小鼠溃疡性结肠炎机制研究

2024-10-03 5 上传者：管理员

摘要：目的探讨青砖茶提取物(QDTE)对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎(UC)小鼠肠道中短链脂肪酸(SCFAs)的影响。方法将小鼠随机分为5组(10只/组),正常组、模型组、阳性组、L-QDTE组[200mg/(kg·d)]和H-QDTE组[400mg/(kg·d)],模型组连续9d给予3%DSS,阳性组和QDTE组连续给药16d,第17d处死，收集小鼠粪便，采用液相色谱质谱联用仪测定粪便中衍生化后的SCFAs含量。结果 SCFAs含量测定的方法学考察结果均符合要求，QDTE增加UC小鼠肠道中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸含量，其中乙酸、丁酸和异戊酸含量呈现剂量依赖性。结论 QDTE可以通过增加SCFAs的含量缓解小鼠UC。

关键词：
液质联用仪
溃疡性结肠炎
短链脂肪酸
胃肠道炎症
青砖茶提取物
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溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种慢性胃肠道炎症性疾病，其特征是黏膜损伤、免疫功能障碍和肠道微生物群失调。近年来，由于饮食和经济水平的提高，UC的发病率在全球呈上升趋势[1]。短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)是指碳原子数小于6的脂肪酸，包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸等，是肠道菌群的代谢物，可维持肠道的稳态并发挥抗炎作用[2]。其中乙酸、丙酸和丁酸3者含量比例占肠道总SCFAs 90%以上，而其他的短链脂肪酸如异丁酸、异戊酸、戊酸和己酸则含量较低，且SCFAs的种类组成及数量与肠炎息息相关[3]。

青砖茶(qingzhuan dark tea, QDT)是黑茶的一种，属于后发酵茶。QDT具有抗炎、抗肿瘤、降尿酸、保护肠道、抗肥胖、抗糖尿病、预防腹泻等多种作用，具有很高的开发利用价值。研究表明，经常喝茶还可以降低UC的发病率[4]。SCFAs是肠道菌群产生的关键代谢物之一，其主要职责是维护肠道的稳定性，减轻结肠炎相关的症状[5],同时也有助于保护肠道的功能[6]。但是，到目前为止，国内外鲜有关于QDT对肠道中SCFAs影响的研究。本实验目的旨在通过构建UC小鼠模型，研究青砖茶提取物(qingzhuan dark tea extract, QDTE)对UC小鼠肠道中SCFAs含量的影响，揭示QDTE对UC小鼠的缓解作用，为今后QDT的开发利用提供依据。

1、材料与方法

1.1实验试剂与仪器

QDT(湖北赤壁赵李桥茶业有限公司);葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)(上海源叶生物科技有限公司);5-氨基水杨酸(5-aminosalicylic acid, 5-ASA)(恒诚药业集团淮南股份有限公司);甲醇(Fisher公司)、乙腈(Fisher公司);乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、2-甲基戊酸(IS)、己酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度均≥98%)。3-硝基苯肼盐酸盐(3-nitrophenylhydrazine hydrochloride, 3-NPH·HCl)(美国Sigma);吡啶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐[N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochlo-ride, EDC·HCl](上海国药集团化学试剂有限公司)。

液相色谱系统购自岛津公司(日本京都),由CBM-20A系统、CTO-20 AC柱温箱、SIL-20 AC自动进样器和LC-20ADXR泵组成。Shim-pack ODS色谱柱(5.0μm, 250mm×4.6mm,岛津公司),保护柱(4.6μm, 5mm×2mm,岛津公司),质谱检测器型号为岛津8040(岛津公司)。

1.2实验方法

1.2.1 HPLC-MS/MS方法

柱温设定30℃;流动相由A(0.1%甲酸水溶液)和B(甲醇)组成；流速是0.35mL/min;梯度洗脱程序如下：0～12min, 33%B;12～26min, 33%～60%B;26～29min, 25%B;进样10μL。

仪器配备了电喷雾离子源，负离子扫描模式。本研究将短链脂肪酸的各个单品进行全扫，再结合单个短链脂肪酸的分子量，得到母离子的质荷比。再将得到的母离子的质荷比进行产物离子优化，得到2～3对离子对，优化结果如表1所示。检测模式设置为多离子反应监控模式(MRM),其他质谱条件如下：离子喷射电压-4.5kV;雾化气流量3.0L/min;干燥气流量15.0L/min; DL温度250℃;加热块温度400℃。

表1 7种短链脂肪酸的质谱条件结果

1.2.2青砖茶提取物的制备

根据文献[7],青砖茶提取物的制备方法如下：将青砖茶用研磨机研磨，用70%乙醇，在24℃提取15min,重复3次(料液比1∶6);提取液经二氯甲烷提取1次，乙酸乙酯提取3次。减压浓缩乙酸乙酯提取物，真空冷冻干燥，得到QDTE。

1.2.3动物实验

50只6周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠(体重18～20g)购自辽宁长生生物技术股份有限公司(中国辽宁),动物许可证号SCXK(辽)2020-0001。所有小鼠实验操作均基于实验动物的护理和使用指南(第八版)。将所有小鼠保持在相对恒定的温度(25±1)℃、湿度(55±5)%和12h明暗循环的房间中适应性饲养1周，饲料和饮用水消毒后由动物自由摄取。将小鼠随机分为5组(n=10),实验周期为16d,具体实验方案如图1所示。对照组小鼠自由饮食和饮用蒸馏水，模型组小鼠于第8天自由饮用3%DSS,阳性组自第8天自由饮用3%DSS,并按照50mg/(kg·d)的剂量连续灌胃16d 5-ASA,青砖茶提取物低剂量组200mg/(kg·d)和高剂量组400mg/(kg·d)自第1天起连续灌胃给药16d,并于第8天开始自由饮用3%DSS[8]。在实验的第17天，对提前禁食12h的小鼠进行麻醉和安乐死，收集小鼠的粪便，在-80℃下保存以供进一步分析。

图1动物实验设计图

1.2.4方法学考察

在对小鼠粪便中SCFAs(乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸)的含量测定之前，对这些SCFAs进行柱前衍生化处理，并对衍生化后的SCFAs进行了方法学考查，包括专属性、线性度、定量下限(LLOQ)、准确度、精密度和稳定性。方法学按照美国食品药品管理局(FDA)的指导原则进行。

(1)专属性。

通过分析含有乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、IS(内标)、己酸的空白组、模型组、阳性组、L-QDT和H-QDT组小鼠粪便样品，评估方法专属性。

(2)线性范围。

配置不同浓度SCFAs工作溶液(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸),以各个短链脂肪酸峰面积比内标峰面积为纵坐标(Y),对应的浓度为横坐标(X)计算回归方程。

(3)准确度和精密度。

精密度和准确度分别用相对标准偏差(RSD)和回收率(RE)进行评价。配置SCFAs的质量控制样品(LQC、MQC和HQC)进行检测，测定RSD和RE。

(4)稳定性。

将质量控制样品(LQC、MQC和HQC)分别在4℃和25℃下保存24h,分析其稳定性。

1.2.5粪便中短链脂肪酸含量测定

将20mg粪便样品放入2mL Eppendorf管中，用200μL 60%乙腈涡旋3min, 10000r/min条件下离心15min,收集上清液。取过滤后的上清液70μL,加入10μL内标(2-甲基戊酸，IS),与40μL的3-NPH·HCl溶液(200mmol/L)混合，随后加入等量的EDC·HCl-6%吡啶溶液(20mmol/L),在30℃水浴30min,立即冷却1min,用10%的乙腈溶液定容至2mL,即得粪便样品衍生化溶液[9-10]。

1.3统计学方法

数据以表示，采用IBM SPSS Statistics 26.0软件进行统计分析。组间差异采用t检验。P<0.05被认为具有统计学意义。

2、结果

2.1方法学

2.1.1专属性

专属性结果如图2所示。在该色谱条件下，短链脂肪酸(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、IS、己酸)之间无干扰，表明该方法具有良好的专属性。

图2混合标准品短链脂肪酸的色谱图

2.1.2线性范围

线性方程和线性系数如表2所示，表明7种分析物(乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸)在0.003～109.0μmol/g内具有良好的线性。

表2 7种短链脂肪酸线性结果(n=3)

2.1.3准确度和精密度

表3结果显示，日内RE和RSD分别为85.91%～113.78%和3.21%～11.83%,日间RE和RSD分别为90.59%～114.74%和2.57%～14.80%,表明该方法准确度和精密度良好。

表3 7种短链脂肪酸精密度和准确度结果(n=6)

2.1.4稳定性

表4显示，在4℃下，24h内分析物的RE值和RSD值分别为85.02%～114.02%和3.51%～13.30%;在25℃下，24h内分析物的RE值和RSD值分别为89.63%～113.09%和2.30%～14.78%,表明该方法稳定性良好。

表4 7种短链脂肪酸稳定性结果(n=6)

2.2粪便中短链脂肪酸含量

图3表明，在造模之前，7种SCFAs中乙酸的响应值最高，其次是丙酸和丁酸，并且在预防性服用QDTE一周后，单个SCFAs含量均有所增加，说明补充QDTE增加了小鼠粪便中SCFAs的水平。如图4所示，与对照组相比，模型组粪便中各SCFAs含量显著下降(P<0.05),表明溃疡性结肠炎抑制了SCFAs的产生。补充QDTE后，丙酸、异丁酸、戊酸、己酸含量增高，其中乙酸、丁酸和异戊酸含量呈显著增高(P<0.05),并且呈现剂量依赖性。

图3 QDTE对造模前SCFAs含量的影响

图4 QDTE对DSS诱导结肠炎小鼠SCFAs含量的影响

3、讨论

SCFAs是肠道微生物群产生的主要代谢物之一，负责维持肠道平衡和缓解结肠炎症。SCFAs可以维护肠上皮屏障功能的完整性，调节宿主胃肠道免疫；SCFAs还可以上调白细胞介素10和22等细胞因子的分泌，进一步缓解动物炎症性肠病[11]。总之，SCFAs具有维持肠黏膜完整性、增强机体免疫、促进肠道电解质平衡、调节肠道微生物、降低肠道pH、减少有害菌及抑制炎性因子的生长、减轻肠道炎症反应等作用。Canfora等[12]发现在7种SCFAs中，乙酸的浓度最高，其次是丙酸和丁酸，这与我们的研究结果一致。据研究，乙酸不仅每天供给机体10%的能量，而且还能抑制核转录因子(NF-κB)的活性，从而减轻肠黏膜炎症反应[13]。丙酸可以增强肠上皮细胞迁移的速度和持久性，有利于肠道损伤的恢复[14],上调抗菌肽Reg 3β的表达以缓解结肠炎。丁酸是最有效的抗炎剂，据研究，丁酸通过激活Akt/mTOR介导的蛋白质合成，增加紧密连接蛋白Claudin-3和Claudin-4表达来增强肠道的紧密连接[15]。戊酸能改善胃肠道功能和肠道完整性[16]。己酸能够调节IL-32、IL-18等关键炎症细胞因子，是炎症的主要调节剂[17]。本实验结果显示，QDTE可使小鼠粪便中SCFAs的含量增加，提示QDT可以预防肠道炎症的发生，保护肠道。

茶具有多种成分，不仅是一种新的食品原料，而且具有丰富的保健功能。因此，对SCFAs进行准确、可靠的定量分析对进一步评估茶与人类健康的联系是十分必要的。普洱茶和红茶可以重塑肠道菌群，促进SCFAs的产生，导致肠道炎症蛋白的表达降低[8]。板栗提取物使模型组的拟杆菌和厚壁菌的丰度发生了变化，显著提高SCFAs水平，尤其是丙酸、丁酸和异戊酸含量，有利于缓解结肠炎[18]。富含哈斯克果酚的提取物以剂量依赖性方式升高了总SCFAs水平，减轻肠屏障功能障碍和炎症[19]。甜茶提取物改变了UC小鼠的肠道微生物群落谱系，调节肠道微生物群组成，提高丁酸的含量[20]。这些研究结果与本试验结果一致，即QDTE可以通过提高肠道中SCFAs含量来缓解结肠炎。

本研究构建了一个基于3-NPH衍生化反应的LC/MS方法，旨在测定小鼠粪便中7种SCFAs的浓度水平。我们所建立的衍生化技术具有温和的反应条件和易于控制的特点，而且所需的反应时间也是适当的。以液相色谱法为基础建立的分析方法灵敏度高、选择性好、重现性好。色谱方法学的研究[21]表明，这项技术可以在29min内分离7种SCFAs。这些SCFAs的回收率介于85%～115%,无论是日内还是日间，其精确度均低于15%。另外，SCFAs的峰面积与其浓度之间呈现出很好的线性关系，其R2值均大于0.99。这种方法不仅操作方便、准确，而且可靠。我们的结果表明，QDTE通过增加SCFAs含量，在缓解溃疡性结肠炎中表现出较好的效果，可能通过调节肠道菌群平衡和减轻炎症反应来发挥作用。这一研究为进一步开发青砖茶提取物作为UC治疗的潜在药物提供了重要参考。

参考文献:

[3]郭共景.溃疡性结肠炎患者粪便短链脂肪酸含量特征的荟萃分析[D].广州:广州医科大学,2021

[9]丛龙杰,邵玉健,沈红,等.粪便内中短链脂肪酸柱前衍生化UHPLC-QTOF-MS/MS分析方法研究[J].药学学报,2020,55(1):131

[11]倪萍,张海波,廖晓鹏,等.短链脂肪酸､色氨酸代谢物及两性离子多糖 A调控动物炎性肠病通路的研究进展[J].中国畜牧杂志,2021,57(6):78

[13]郑海玲,孙金辉,崔培,等.短链脂肪酸在水产养殖中的应用研究进展[J].中国饲料,2024(1):108

基金资助:湖北科技学院博士启动项目基金(Q201810); 药物高通量筛选技术国家地方联合工程研究中心开放课题基金(K20201006);

文章来源:叶丹,赵依叶,苗潇磊,等.青砖茶提取物缓解小鼠溃疡性结肠炎机制研究[J].湖北科技学院学报(医学版),2024,38(05):374-379.