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青蒿素减轻心脏骤停-心肺复苏所致肺损伤的作用及机制

2024-04-23 36 上传者：管理员

摘要：目的探讨青蒿素减轻心脏骤停-心肺复苏(CPR)所致肺损伤的作用及机制。方法22头大白猪随机分为假手术(S)组(6头)、CPR组(8头)和CPR+青蒿素组(8头)。CPR组和CPR+青蒿素组采用电刺激诱导心脏骤停9 min与人工CPR 6 min的方法建立猪CPR模型。造模成功后，CPR+青蒿素组在2 h内静脉匀速泵入青蒿素4.8 mg/kg, S组和CPR组采用相同方法给予等量生理盐水。于造模前及造模后1、2、4 h,应用脉搏指示连续心排血量监测仪检测血管外肺水指数(ELWI)和肺血管通透性指数(PVPI)的变化。于造模后24 h,采用Western blot法检测NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、剪切型Caspase-1(cleaved Caspase-1)和消皮素D-N端(GSDMD-N)蛋白表达，ELISA法检测IL-1β和IL-18含量。结果与S组相比，在造模后1、2、4 h时CPR组ELWI和PVPI升高，在造模后1、2 h时CPR+青蒿素组PVPI升高(P<0.05)。与CPR组相比，在造模后2、4 h时CPR+青蒿素组ELWI和PVPI降低(P<0.05)。与S组相比，CPR组和CPR+青蒿素组肺组织中cleaved Caspase-1和GSDMD-N蛋白表达及IL-1β和IL-18含量升高(P<0.05)。与CPR组相比，CPR+青蒿素组肺组织中NLRP3、cleaved Caspase-1和GSDMD-N蛋白表达及IL-1β、IL-18含量下降(P<0.05)。结论青蒿素能抑制猪心脏骤停-CPR后肺组织中NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡过程，从而减轻心脏骤停-CPR所致肺损伤。

关键词：
心肺复苏
心脏骤停
细胞焦亡
肺损伤
青蒿素
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心脏骤停患者在恢复自主循环后，紧接着进入心脏骤停后综合征的病理生理阶段，易继发全身多器官功能不全，进而造成患者住院期间死亡或出院后生存质量下降[1,2]。研究显示，肺作为全身氧供来源的重要器官，心脏骤停-心肺复苏(CPR)过程中会出现急性肺损伤，从而使机体因氧供不足而加重全身多器官功能障碍程度，是患者预后结局不良的重要危险因素[3,4]。近年来研究发现，青蒿素可通过抗炎、抗氧化、减轻气道高反应、逆转气道重塑等途径对多种肺部疾病发挥治疗作用[5],但尚无对心脏骤停-CPR所致肺损伤治疗的研究报道。另外，细胞焦亡作为一种炎症性细胞死亡的新形式，其主要由NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体介导的细胞破裂和炎症介质释放所致，已被证实能加剧炎症相关肺部疾病的损伤程度[6],可能成为心脏骤停-CPR所致肺损伤的潜在干预靶点。本研究拟建立猪CPR模型，初步探讨青蒿素对心脏骤停-CPR所致肺损伤的治疗效果，同时观察其对受损肺组织中NLRP3细胞焦亡途径的调控作用，以期为临床转化应用提供理论依据。

1、材料与方法

一、材料

1.实验动物

普通级雄性大白猪22头，4～6月龄，体重(36.6±2.6) kg, 购自上海甲干生物科技有限公司[生产许可证号：SCXK(沪)2020-0006]。本研究在浙江大学医学院附属第二医院完成，已获得该院动物实验伦理审查委员会审批(批号：2022-027)。

2.试剂与仪器

青蒿素购自美国APExBIO公司；替来他明/唑拉西泮购自法国Virbac公司；赛拉嗪购自吉林华牧动物保健公司；丙泊酚购自西安力邦制药有限公司；肾上腺素购自天津金耀药业有限公司；NLRP3、剪切型Caspase-1(cleaved Caspase-1)和消皮素D-N端(GSDMD-N)抗体购自美国Proteintech公司；IL-1β和IL-18 ELISA检测试剂盒购自上海美轩生物科技有限公司；Monnal T75呼吸机购自法国Air Liquide公司；iM60心电监护仪购自深圳市理邦精密仪器股份有限公司；M Series除颤监护仪购自美国ZOLL公司；脉搏指示连续心排血量(PiCCO)监测仪购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；蛋白质电泳仪、多功能凝胶成像仪和酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

二、方法

1.实验分组和给药

将22头猪随机分为假手术(S)组、CPR组、CPR+青蒿素组，分别为6、8、8头。待猪适应性喂养1周后，开始正式实验。S组仅进行准备工作，CPR组和CPR+青蒿素组建立猪CPR模型。在造模成功后，CPR+青蒿素组在2 h内静脉匀速泵入青蒿素4.8 mg/kg, S组和CPR组采用相同方法给予等量生理盐水。

2.造模

造模步骤大体如下[7]:替来他明/唑拉西泮5 mg/kg联合赛拉嗪1 mg/kg肌肉注射诱导麻醉，丙泊酚2 mg/kg静脉麻醉后以4 mg·kg-1·h-1维持麻醉状态。气管插管，机械通气，连接心电监护仪。经右侧股动、静脉分别置入压力监测导管，经左侧股动脉、右侧颈内静脉分别置入PiCCO监测仪监测动脉端和静脉端导管，经右侧颈外静脉置入室颤诱导电极。待猪生命特征稳定后，经电极释放1 mA交流电诱导室颤并观察9 min, 然后参照CPR指南实施30∶2的人工胸外按压与球囊辅助通气，应用按压监测装置，保证按压深度5～6 cm、频率100～120次/分，且在CPR 2 min时静脉推注肾上腺素20 μg/kg, 每3分钟重复1次，连续CPR 6 min后给予150 J双向波电除颤1次。若猪未恢复自主循环，即刻重启CPR 2 min后电除颤1次，重复此流程直至自主循环恢复，若5次后未恢复宣告抢救失败。计算自主循环恢复(ROSC)率，即复苏成功的动物占总动物数的百分比。

3.记录猪基础生命体征与造模情况

应用心电监护仪经体表心电电极、血管内压力导管、血温探头和血氧饱和度探头，监测猪心率、血压、体温和脉搏血氧饱和度情况。记录猪造模期间的CPR结局，以及造模后24 h的存活情况。

4. PiCCO监测仪检测猪肺损伤指标的变化

于造模前及造模后1、2、4h, 应用肺热稀释技术与动脉搏动曲线分析技术，经PiCCO监测仪检测血管外肺水指数(ELWI)和肺血管通透性指数(PVPI)的变化。

5. Western blot法检测猪肺组织中NLRP3、cleaved Caspase-1和GSDMD-N蛋白表达

于造模后24 h, 处死各组猪，取左肺下叶组织标本，剪成小块，置于― 80 ℃冻存备用。检测时，各组取少许组织样本制成匀浆，在4 ℃下10 000×g离心10 min, 取上清液检测蛋白浓度，加入上样缓冲液95 ℃加热10 min, 随后进行蛋白上样、SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，将蛋白转移到PVDF膜，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h。加入NLRP3抗体(1∶1 000)、cleaved Caspase-1抗体(1∶1 000)和GSDMD-N抗体(1∶1 000)于4 ℃孵育过夜，经TBST漂洗后加入二抗室温孵育1 h, 再经TBST漂洗后进行电化学发光显影、拍照和分析，以GAPDH为内参计算目的蛋白表达情况。

6. ELISA法检测猪肺组织中IL-1β和IL-18含量

于造模后24 h, 处死各组猪后取左肺下叶组织标本，剪成小块冻存于―80 ℃,择期进行组织匀浆、离心获取上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测猪肺组织中IL-1β和IL-18含量。

三、统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量数据用均数±标准差

表示，行单因素方差分析；计数资料用百分比表示，行Fisher确切概率法；P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

一、各组基础生命体征及造模情况

各组心率、血压、体温、脉搏血氧饱和度均处于正常生理范围。造模期间，CPR组和CPR+青蒿素组分别复苏成功8头和6头，两组猪ROSC率分别为100%与75%,比较差异无统计学意义(P>0.05)。CPR组在造模后11 h和20 h时分别死亡1头，CPR+青蒿素组未见死亡，两组造模后24 h存活率均为75%。

二、各组造模前后肺损伤指标的变化

三组造模前ELWI和PVPI比较差异无统计学意义(P>0.05);与S组相比，在造模后1、2、4 h时CPR组ELWI和PVPI升高，CPR+青蒿素组在造模后1、2 h时PVPI升高(P<0.05);与CPR组相比，CPR+青蒿素组在造模后2、4 h时ELWI和PVPI降低(P<0.05)(图1)。

三、各组造模后肺组织中NLRP3、cleaved Caspase-1和GSDMD-N蛋白表达

与S组相比，CPR组和CPR+青蒿素组在造模后24 h时肺组织中cleaved Caspase-1和GSDMD-N蛋白表达升高(P<0.05);与CPR组相比，CPR+青蒿素组在造模后24 h时肺组织中NLRP3、cleaved Caspase-1和GSDMD-N蛋白表达下降(P<0.05)(图2)。

四、各组造模后肺组织中IL-1β和IL-18含量

与S组比较，CPR组和CPR+青蒿素组在造模后24 h时肺组织中IL-1β和IL-18含量升高(P<0.05);与CPR组相比，CPR+青蒿素组在造模后24 h时肺组织中IL-1β和IL-18含量下降(P<0.05)(图3)。

图1 各组造模前后肺损伤指标的变化

图2 各组造模后肺组织中NLRP3、cleaved Caspase-1和GSDMD-N蛋白表达

图3 各组造模后肺组织中IL-1β和IL-18含量

3、讨论

既往研究发现，青蒿素因具有结合疟原蛋白后改变疟原虫的细胞结构和功能，以及阻碍虫体蛋白合成等生物学作用，故一直被用于虫媒传染病疟疾的积极治疗[8]。近年来研究发现，青蒿素还有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗动脉粥样硬化、免疫调控等多种生物学效应，从而被拓展应用于全身多种疾病的治疗研究，且在肺癌、新型冠状病毒感染、支气管哮喘、急性肺损伤等肺部疾病的治疗中体现出良好的应用效果[5,8]。CAO等[9]在非小细胞肺癌小鼠模型中研究发现，青蒿素能通过抑制含WW域的转录共激活因子1/程序性死亡配体1信号途径，加强表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的抗肿瘤免疫活性，并克服其耐药性，从而提升肺癌的治疗效果。ZHOU等[10]在体外实验中发现，青蒿素能靶向抑制新型冠状病毒活性，从而对人肝癌Huh7.5细胞系和人肺癌A549-hACE2细胞系产生保护效应。王瑞茵等[11]在支气管哮喘小鼠模型中研究发现，青蒿素能通过减轻肺组织的炎症细胞浸润程度，改善支气管哮喘所致的气道高反应性与炎症反应，从而缓解支气管哮喘症状。HAO等[12]在急性肺损伤小鼠模型中研究发现，聚乙二醇修饰的青蒿素纳米药物能通过调节抗炎、抗氧化途径，从而有效减轻脂多糖刺激诱导的肺损伤程度。研究发现，青蒿素通过启动血红素加氧酶1介导的抗氧化途径，从而减轻大鼠肾缺血-再灌注所致的远隔肺损伤[13],以及通过启动细胞存活及抗炎途径来改善大鼠失血所致的肺损伤[14]。目前，关于青蒿素对心脏骤停-CPR所致肺损伤的治疗效果报道较少。

研究证实，在心脏骤停-CPR期间，肺会遭受胸部按压相关肺挫伤、肺缺血-再灌注损伤、系统性炎症反应等多重致损因素，进一步造成肺组织结构水肿塌陷、肺通气换气功能下降及出现全身缺氧表现，从而成为患者恢复自主循环后多器官功能障碍加剧的重要因素[15]。基于上述问题，结合青蒿素对肺部疾病的治疗证据，本研究初步探讨青蒿素对心脏骤停-CPR所致肺损伤的治疗效果。本研究选择与人类近亲源性的大型动物猪作为实验动物，应用临床常见的室颤型心脏骤停及中等时长的骤停时间建立动物模型，并在造模成功后即刻给予青蒿素，以期获得利于临床转化的研究证据。参照SORDI等[14]中关于青蒿素在缺血-再灌注损伤的有效治疗剂量，本研究选择青蒿素4.8 mg/kg作为治疗剂量。结果显示，CPR组和CPR+青蒿素组造模后肺损伤指标ELWI和PVPI升高，提示心脏骤停-CPR造成的肺损伤发生；CPR组上述肺损伤指标呈持续上升趋势，而CPR+青蒿素组在造模后1 h时上述指标即呈好转趋势，且CPR+青蒿素组在造模后2、4 h时肺损伤指标均优于CPR组，提示青蒿素能够减轻心脏骤停-CPR所致的肺损伤。

细胞焦亡是一种新型程序性细胞死亡，能破坏细胞膜而释放大量炎症介质，从而在炎症相关疾病的病理生理过程中发挥重要作用[16]。研究发现，NLRP3与凋亡相关微粒蛋白、前体Caspase-1组成炎症小体，其在各种病理损伤因素的刺激下NLRP3被激活并逐级活化下游效应因子前体Caspase-1,cleaved Caspase-1一方面水解消皮素D氨基端形成有活性的GSDMD-N后特异性结合细胞膜形成破孔，另一方面剪切前体IL-1β和前体IL-18形成成熟的IL-1β和IL-18,后者经细胞破孔释放到细胞外后扩大炎症反应，这已成为细胞焦亡发生的经典途径[16]。在诸多炎症相关的肺部疾病中，如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺癌、急性肺损伤、矽肺、肺动脉高压、肺结核等，NLRP3细胞焦亡途径已被证实是这些疾病致损过程的重要影响因素及潜在治疗靶点[6]。目前发现炎症是心脏骤停-CPR所致肺损伤的重要途径之一[17]。CUI等[18]建立急性呼吸窘迫综合征小鼠模型，发现青蒿素能抑制NLRP3炎症小体激活，从而减少肿瘤坏死因子α、IL-1β、IL-18、IL-6等多种促炎介质的含量，进而减轻脂多糖刺激诱导的急性肺损伤及水肿程度。LIU等[19]建立肾缺血-再灌注损伤大鼠模型，发现青蒿素能通过减轻氧化应激来抑制NLRP3炎症小体激活，从而减少远隔器官肺组织的炎症因子水平及炎症细胞浸润程度，改善肺毛细血管渗漏及组织水肿程度。本研究在造模后24 h发现，CPR组和CPR+青蒿素组肺组织中cleaved Caspase-1和GSDMD-N蛋白表达上调，同时IL-1β与IL-18含量增加，提示NLRP3细胞焦亡途径参与心脏骤停-CPR所致肺损伤的病理生理过程；然而，CPR+青蒿素组肺组织中上述蛋白表达和炎症介质含量均低于CPR组，提示青蒿素通过抑制NLRP3细胞焦亡途径，从而对心脏骤停-CPR所致肺损伤产生保护作用。

综上所述，青蒿素可能通过抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡过程，从而减轻猪心脏骤停-CPR后肺组织的炎症反应程度，进而对CPR后肺损伤产生保护作用。

基金资助:丽水市科技计划(2022SJZC015､2022GYX36､2023GYX24);

文章来源:张龚平,谢璐涛,卢晓驰,等.青蒿素减轻心脏骤停-心肺复苏所致肺损伤的作用及机制[J].江苏医药,2024,50(03):222-227.