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毛细管电泳分析2型糖尿病患者淀粉样蛋白多肽寡聚化

2024-10-12 67 上传者：管理员

摘要：目的：采用毛细管电泳(CE)研究血液中小分子淀粉样变成分，旨在为预测糖尿病淀粉样变损害提供一种标志物和检测方法。方法：使用Premier HB9210液相色谱分析仪、东芝40全自动生化分析仪、雅培i2000全自动电化学发光免疫分析仪测定全血和血清中的糖化血红蛋白、葡萄糖、C肽等18项生物标志物水平；用XS-1000i全血细胞析仪测定血细胞计数；同时采用安捷伦7100毛细管电泳仪分析乙腈沉淀后血清中小分子聚合谱系。结果：健康体检组血清中发现血糖、糖化血红蛋白、胰岛素、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、白蛋白、同型半胱氨酸和尿酸8项指标显著优于糖尿病组(P<0.05)。CE分析发现糖尿病患者血清中存在稳定丰度蛋白分子谱系，稳定维持存在。结论：首次报道应用CE检测到糖尿病患者血清中存在小分子聚合谱系现象，保留时间在7～8min,分析血清小分子聚合谱系，辅助检测糖尿病患者淀粉样变损害，提供新的检测方法和检测标志物。

关键词：
毛细管电泳
流行病学
淀粉样变
糖尿病
胰岛淀粉
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根据流行病学调查，全球2型糖尿病患者已经超过4亿，严重影响人们的身体健康，其中糖尿病并发淀粉样变的现象越来越受到临床重视，已发现其淀粉样变的前蛋白为人胰岛淀粉样蛋白多肽(hIAPP)。大量基础研究报道，hIAPP分子具有寡聚化潜能，形成高分子淀粉样变聚合或淀粉样变纤维。淀粉样变蛋白聚合体分子对机体细胞具有毒性作用，临床病理也发现了糖尿病患者的器官组织内的淀粉样变斑块沉积，受累器官90%发生于胰腺组织中[1]。因此探索糖尿病患者机体内淀粉样变聚合体分子水平和特征，将有利于辅助检测糖尿病的淀粉样变。

Bram等于2012年首先报道了用尺寸排阻色谱(SEC)法分析分子聚合体，可检测蛋白分子单体、二聚体以及多聚体，也有采用质谱联用的离子迁移谱(IMS-MS)检测蛋白寡聚化[2],这些技术为临床上检验分子聚合提供了新的方向。目前临床上少有检测血液内hIAPP分子以哪种聚合体形式存在，血液中的细胞及蛋白分子是否干扰检测还缺少相关系统研究。研究血液淀粉样变前蛋白单体以及聚合成多聚体，有望为预测淀粉样变发生及淀粉样变形成的分子机制提供实验支撑。

毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)是一种高效分离的快速检测技术，已有报道利用CE方法检测血清淀粉样变蛋白Aβ1～42[3],适合于临床医学快速检验。已经证实糖尿病患者血清中存在hIAPP蛋白聚合分子，观测血清中该蛋白的存在形式将有利于辅助分析糖尿病淀粉样变状态，也可以为预测淀粉样变引发的并发症提供一种新型检测技术。

1、资料与方法

1.1临床资料

按照2020年2型糖尿病早期大血管病变无创性检查的专家共识，收集2020年内某医院临床糖尿病诊治患者120例，年龄40～75岁，其中男60例，女60例；随机选择本院健康体检者120例，年龄42～76岁，其中男60例，女60例。所有被研究对象均空腹采集静脉血5mL分离血清，2mL EDTA抗凝全血。本实验的全过程符合医学伦理委员会要求。

1.2方法

(1)利用XS-1000i型全血细胞分析仪进行全血细胞计数检测。所用试剂和质控品均为SYSMEX配套试剂。利用东芝40全自动生化分析仪及该分析仪配套试剂(中生北控，质控品为朗道)测定血清葡萄糖、甘油三酯等14项血清生物化学标志物水平。采用Premier HB9210液相色谱分析仪硼酸盐亲和高效液相色谱法(所用试剂和质控品均为仪器配套)测定糖化血红蛋白含量。采用雅培i-2000型自动生化分析仪化学发光微粒子免疫法(所用试剂与质控品均为仪器配套)测定血清同型半胱氨酸、胰岛素和C肽水平。(2)使用南京金斯瑞的hIAPP单体标准品，超纯水配置成0.5mg/mL母液，分装。超纯水将单体配成0.2mg/mL后，37℃温箱孵育7d,制备成hIAPP聚合体，备用于CE。hIAPP单体上CE宜在配好后尽快上样。(3)血清标本与乙腈按照1∶1.2的比例进行混合，冰浴1h,涡旋混匀30s, 12 000r/min、4℃下离心10min,上清部分用于CE,沉淀部分作为备研究部分-80℃储存。所用乙腈为进口色谱纯。(4)CE检测使用安捷伦7100毛细管电泳仪，毛细管电泳仪配备UV检测器(Agilent Technology, USA),以波长220nm在线实时记录CE-UV检测结果，未涂层石英毛细管50μm (i.d.)(安捷伦原厂配置),有效长度42cm,运行缓冲液为pH 9.3,20mmol/L硼砂缓冲液，所有试剂及标本在上机前均用0.45μm滤膜过滤。样品进样选择压力进样，50mbar, 4s,支架盒温度20℃,0.2min更改电压25kV,运行时间10min,进样每帧样品之间用1mol/L NaOH、超纯水和运行缓冲液各冲洗2min。hIAPP单体和孵育后hIAPP聚合体，以及乙腈处理后血清均按照上述实验条件，进行CE处理。

1.3统计学方法

应用SPSS22.0软件分析数据，分析血液生物标志物水平，两两比较采用t检验进行计算，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1分析两组患者血液标志物

对两组血液进行检测，包括血糖、糖化血红蛋白、白蛋白、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、胰岛素、同型半胱氨酸、尿酸等18项生物学标志物和血液细胞计数统计结果见下表1。其中健康体检组血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、胰岛素、尿酸、白蛋白和同型半胱氨酸8项标志物水平显著优于糖尿病组，差异有统计学意义(P<0.05),两组其他标志物无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1两组血清和全血标志物水平比较(均值)

2.2分析两组人群血清CE小分子蛋白谱系

收集所有研究对象血清，按照本组优化的乙腈沉淀血清高丰度蛋白试验方法，沉淀血清中的白蛋白和球蛋白等高丰度蛋白，上清部分利用CE分析蛋白质丰度，结果可见毛细管保留时间内出现丰度稳定高于基线的蛋白分子，作为可见蛋白分子谱系，在与健康体检组分子谱系对比中发现，在糖尿病患者组低分子谱系中，于7～8min出现新的谱峰。同时hIAPP单体的电泳谱峰出现在3min, hIAPP聚合体的谱峰出现在8min。见图1。

图1毛细管电泳分析血清蛋白分子谱系

3、讨论

糖尿病临床检验项目主要围绕血糖及代谢相关标志物，而长期糖尿病会导致并发淀粉样变损害。临床普遍采用统计患病组与对照组之间的各指标差异性，来辅助临床诊断和评价治疗效果。为探索糖尿病患者淀粉样变成分的分子聚合状态，首先检测血清和全血的生物标志物，计入统计合计18项，其中与健康体检者之间存在差异的有8项标志物(P<0.05),分别为血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、胰岛素、尿酸、白蛋白和同型半胱氨酸，这些标志物之间的差异与以往报道相似[4-7]。其中与报道有争议的标志物是总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇[8],比对查阅文献认为这种差异可能与选取对照组所在地区人群的饮食习惯相关，修子冉等[9]的报道也未提及总胆固醇与糖尿病的相关性。这些糖尿病患者体内的异常生化指标或许与蛋白质的异常折叠和堆积有关，不过并无直接证据证实。

已发现有超过40种已鉴定的人类疾病涉及某些蛋白质的错误折叠，积聚在体内，对细胞和器官造成损害并导致疾病发生。2型糖尿病是这些蛋白质错误折叠障碍(PMD)之一，涉及hIAPP错误折叠并积聚于人身器官内，研究发现在人体胰腺、肾脏、心脏、大脑、血液循环以及血管周围组织等都有聚集，但主要聚集在胰腺中，并对胰岛细胞造成损伤并影响葡萄糖调节，hIAPP的体外聚集导致胰岛β细胞受损的实验模型已经建立[10]。淀粉样变前蛋白多为小分子蛋白例如TTR、Aβ多肽、Tau蛋白等，采用分析分子聚合的技术可以帮助研究淀粉样变或筛选诊断标志物。目前有报道采用IMS-MS来监测hIAPP寡聚化分子，IMS-MS显示hIAPP孵育的最初几分钟，就检测出六聚体。本实验采用CE分析经过乙腈沉淀处理后的血清蛋白，与健康体检组相对比，发现糖尿病患组在7～8min出现稳定的分子谱系。在将hIAPP单体孵育聚合后，经CE分析所得出的谱系在8min处出现，分析这一波谱的迁移原因，主要考虑受孵育hIAPP单体到聚合体过程中体外聚合条件的影响，与体内hIAPP寡聚体的构象差异，Yi等[11]提到过孵育条件的变化对hIAPP聚合的影响。实验中得到的分子谱系特征有可能作为糖尿病患者淀粉样变分子形成机制研究靶点，并成为辅助检查糖尿病淀粉样变的标志物。结合CE方法快速、微量的特征，有望成为应用于临床糖尿病诊疗的辅助手段。

综上所述，利用CE分析糖尿病患者小分子丰度蛋白发现的淀粉样变分子聚合生物标志物，其形成丰度显著高于基底线，有可作为糖尿病患者检测标志物的潜能。

参考文献:

[4]朱雅坤.2型糖尿病合并高血压相关危险因素探讨[J].中国医学工程,2020,28(7):100-102.

[5]森干,李永生,孙方旭,等.2型糖尿病合并高血压的危险因素及其列线图预测模型的构建[J].重庆医学,2022,51(13):2189-2193.

[6]高飞,张丽娟,张文,等.关于2型糖尿病大血管病变相关危险因素分析[J].当代医学,2019,25(2):23-25.

[7]郑志友,李兴照,谢雅革.糖尿病心肌病患者HbA1c､NT-proBNP､Hcy､SOD和TC水平的变化及其临床意义[J].检验医学,2023,38(3):282-286.

[8]宋华隆,高鹰.血尿酸水平与2型糖尿病发病风险的关联队列研究[J].中国全科医学,2023,26(15):1831-1839.

[9]修子冉,高政南,罗兰,等.非高密度脂蛋白胆固醇､甘油三酯与高密度脂蛋白胆固醇比值及血清甘油三酯葡萄糖乘积指数对40岁以上女性新诊断糖尿病前期患病的预测价值[J].中国糖尿病杂志,2023,31(2):87-91.

文章来源:郑丽丽,孙续国,宋林.毛细管电泳分析2型糖尿病患者淀粉样蛋白多肽寡聚化[J].医学理论与实践,2024,37(19):3354-3357.